冈田酸诱导阿尔兹海默病动物模型的研究进展

张 鑫, 王军燕, 魏玉婷, 刘鸿鑫, 朱田田, 严兴科

(甘肃中医药大学 针灸推拿学院, 甘肃 兰州, 730000)

阿尔茨海默病(AD)是老年阶段最常见的痴呆类型，以进行性认知功能减退为主要特征[1]。随着人口老龄化的日趋严重, AD的发病率呈不断上升趋势。作为全球难治性疾病, AD无法完全根治，当前治疗方法仅能缓解相关症状[2]。关于AD的确切病因及发病机制至今仍不明确，主要有β-淀粉样蛋白(Aβ)级联假说、tau蛋白磷酸化假说、胆碱能神经元假说、氧化应激假说、自由基损伤假说等[3]。研究[4-5]发现, tau蛋白磷酸化与AD患者的痴呆程度相关性更高。tau蛋白磷酸化假说认为, AD发病是由过度磷酸化tau蛋白(p-tau)聚集形成神经纤维缠结(NFTs)而造成神经细胞大量损伤引起。因此tau蛋白被很多学者认为是治疗AD的潜在有效靶点[6]，而临床前模拟以tau蛋白磷酸化为特征的 AD动物模型至关重要。

目前，已建立的tau蛋白动物模型有rTg4510、JNPL3、pR5等转基因鼠模型[7-8]。但转基因鼠价格较高，且存在基因突变可能，易导致模型鼠出现视觉、嗅觉或肌肉等缺陷，会对行为分析产生影响[9]。冈田酸(OA)是一种强聚醚海洋毒素，可以通过抑制抑制蛋白磷酸酯酶-1(PP1)、蛋白磷酸酯酶-2A(PP2A)活性达到调控tau蛋白磷酸化水平的目的[10]。根据该特性以及利用OA造模操作简单、成本低、造模周期较短等特点, OA被广泛应用于国内外tau蛋白磷酸化改变为特征的AD模型制作中，但文献报道中OA的具体应用方法尚不统一。本文对实验动物选择、OA制备、注射部位、注射剂量、模型评价以及病理学机制进行综述，以期为该种模型应用提供参考。

1 实验动物选择

文献[11]报道，脑内注射OA的动物模型多为啮齿类动物，包括C57BL/6 J小鼠、ICR小鼠、昆明种小鼠以及SD、Wistar大鼠等。与小鼠比较, SD、Wistar大鼠具有行为、情绪变化特征，行为表现多样，情绪敏感，能进行高级神经活动研究，且SD大鼠的神经系统与人类相似，更适用于奖励和惩罚实验、迷宫实验等方面的研究[12-13]。研究[14]表明，雌激素对AD有神经保护作用，为降低实验误差，实验鼠性别以雄性多见。鼠的体质量不同，其大脑区域的立体定向坐标也会不同，当前各个研究中大鼠脑立体定位坐标参考包新民等[15]的《大鼠脑立体定位图谱》、GEORGE PAXINOS等[16]的《大鼠脑立体定位图谱》，小鼠脑区定位多参考《小鼠脑图谱》[17]。为更准确进行脑立体定位，本研究选用脑内注射OA的大鼠体质量(300±50) g, 小鼠体质量(26±4) g。根据现有文献，本文总结了OA动物模型的具体制备方法、行为学表现和病理改变[18-34], 见表1。

2 实验方案及操作

2.1 OA的制备方法

OA是一种强聚醚海洋毒素，实验用OA主要从人工培养的甲藻、单细胞海洋微生物中提取，也可进行化学合成[35]。高纯度OA形态为无色晶体，分子式为C44H68O13，具有亲脂性以及很强的稳定性，不溶于水[36]。OA通常经二甲基亚砜(DMSO)、无水乙醇或甲醇进行溶解后使用[37]。有研究使用可直接溶于水的OA钠盐(分子式为C44H67NaO13)和OA铵盐(分子式为C44H67KO13)进行脑内注射。

DMSO被称为“万能溶剂”，在常温下为无色、无臭、呈微苦味的透明液体，体积分数较高时具有细胞毒性[38]。研究[39]表明，低剂量DMSO (0.1%～2.0%)能造成大鼠和小鼠淋巴细胞、神经细胞等多种体外细胞凋亡。甘津凡等[40]使用不同浓度DMSO对斑马鱼胚胎进行干预，结果显示, DMSO浓度仅在0.3%时能造成斑马鱼胚胎发育障碍，DMSO浓度越高，影响程度越大。

临床开展研究使用无水乙醇、甲醇进行OA溶解，并与生理盐水或人工脑脊液进行稀释注入实验动物脑内。研究[41-42]表明，无水乙醇、甲醇均具有刺激性，二者对中枢神经系统具有抑制作用，也具有损害血细胞的作用。目前，对无水乙醇、甲醇的使用没有明确的安全浓度。JIANG C等[43]发现，在乙醇处理的蛋白酶体亚单位中，蛋白酶体亚单位发生了过度磷酸化。YANG M等[44]采用甲醇喂养小鼠后发现，小鼠脑内p-tau蛋白水平增高，海马神经细胞凋亡，小鼠的认知功能也下降。

DMSO、无水乙醇、甲醇对动物神经系统均能产生损伤，因此在进行实验时，给予动物单纯进行DMSO、乙醇、甲醇稀释液脑内注射，有助于明确OA溶解剂对实验动物的影响。

2.2 注射部位和剂量

AD病理表现为脑体积缩小，脑沟加深、变宽，脑回萎缩，以海马区萎缩最为明显[45]。海马是处理叙述性记忆的主要区域，参与空间讯息的储存与处理，因此动物海马附近的侧脑室及海马(CA1、3区)是注射OA的主要部位，为使OA有效吸收，需明确注射及留针时间。研究[46]认为，实验动物进行脑内注射时，注射器针头可引起大脑创伤，导致不必要的脑细胞死亡，干扰实验结果，因此在海马区附近进行注射或对远离注射处的海马组织进行结果分析能有效减少偏差。

研究[47]表明, OA对PP2A、PP1的半抑制浓度(IC50)为0.1～1.0 nmol/L和20～100 nmol/L。ARIAS C等[48]将不同剂量(25、50、150、300 ng)的OA分别注射入Wistar大鼠海马区，结果显示, OA注射剂量为50 ng、150 ng和300 ng均会对大鼠海马区CA1产生损伤，以150 ng和300 ng的损伤最为明显，注射剂量为25 ng则无明显影响; 给予大鼠300 ng海马区注射后，大鼠易出现头部抖动、咀嚼、颤抖等不良反应。BROETTO N等[49]分别将100、200 ng OA注入大鼠脑内，结果显示，注射剂量为200 ng的大鼠认知功能低于注射剂量为100 ng的大鼠, p-tau蛋白浓度高于100 ng的大鼠。在其他研究中，通常采用150 ng的OA剂量进行脑内注射(见表1)。多数研究通常将OA一次性注射进动物脑内建立AD模型中，但也有使用侧脑室导管埋置术[50-51]对动物进行多次OA脑内注射，或间隔数天继续进行脑内注射。

表1 OA脑内注射动物建模方法、学习记忆能力检测和机制

2.3 模型评价

模型复制结束后，通过学习记忆能力检测评价模型是否成功。本文对学习记忆能力检测方法进行总结，包括Morris水迷宫(MWM)、新物体识别实验(ORT)、巴恩斯(Barnes)迷宫、Y迷宫(YM)。

Morris水迷宫实验[52]利用动物(大鼠、小鼠)会游泳但不喜水的特点，将其放于水中寻找隐藏在水中的平台。该实验主要用于测试动物对空间位置感的学习记忆能力。水池是MWM最主要的附件之一，大、小鼠所需游泳池尺寸不一，小鼠约为大鼠的50%, 平台直径也较小(7.5 cm)。实验中水温和水的浑浊度是实验的关键，水温一般要求20 ℃左右，为避免实验动物在水中观察到平台，通常使用二氧化钛、牛奶使水池中的水变浑浊。该实验指标是将以鼠每日4次训练潜伏期的平均值作为鼠当日的学习成绩; 在空间探索实验时，对规定时间内鼠穿过平台所在位置的次数、所在目标象限停留时间等进行统计，以评估鼠的空间记忆能力。

新物体识别实验[53]是利用啮齿类动物对新奇物体喜探究的习性建立的评定其记忆识别能力的检测方法。该实验不需要任何奖励或惩罚，是通过记录和计算实验动物对熟悉物和新物体的探索时间进行记忆力评估。为更好地模拟人类学习记忆行为，在进行该实验时，需保持外界环境安静，保证动物在自由活动状态下进行新旧事物探索。该实验由3个阶段构成: 适应期、熟悉期和测试期。实验指标包括实验动物对物体的辨别指数(DI)和识别指数(RI)。DI=(探索新物体时间-探索旧物体时间)/(探索新物体时间+探索旧物体时间)，正分表示在新物体上花费的时间更多，负分表示在旧物体上花费时间更多，零分表示无效偏好。RI=探索新物体时间/(探索新物体时间+探索旧物体时间)×100%, >50%表示对新物体偏好, <50%对旧物体偏好, 50%表示无偏好。

巴恩斯迷宫[54]是利用啮齿类动物避光喜暗、喜探索的特性建立的，用于评估实验室啮齿类动物的空间学习记忆、导航能力，较Morris水迷宫应激性小。实验时将动物放置在迷宫中央，通过适当刺激，如强风、灯光、噪音等，强制动物躲藏，同时记录动物找到正确洞口的时间、进入错误洞口的次数、重复进入错误的洞口数。Barnes迷宫的构建和测试方法根据实验对象不同有所不同，如一些迷宫外线索对大鼠有效，对小鼠可能需要迷宫内线索进行指引，并需要遮挡迷宫外视野。该方法需要4～7次的测试来检测啮齿类动物学习和记忆能力。

Y迷宫[55]由3个臂组成，各个臂夹角120°，该实验包括食物奖赏测试和电刺激测试。食物奖赏测试是利用啮齿动物对新环境的探究习性来进行，动物不需要学习任何规则; 电刺激测试是利用啮齿动物避光喜暗习性设计，通过电刺激促使处在阴暗区的动物逃离至光亮区。YM将动物在各个臂停留的时间作为评价其空间识别记忆能力的指标，以动物在各个臂的穿梭次数作为其活动能力的指标。

2.4 相关病理学机制

Tau蛋白过度磷酸化引起的NFTs是AD发病的关键，tau蛋白磷酸化程度受蛋白激酶与磷酸酶调节。GSK-3β[56]、MAPK[57]和CDK5等[58]蛋白激酶能促进tau蛋白在多个与AD发生相关的位点磷酸化。磷酸化后的tau蛋白可由PP2A等磷酸酶去磷酸化。蛋白激酶与蛋白激酶，蛋白激酶与磷酸酶，被证实存在协同作用，相互影响[59]。

炎症是AD的一个重要特征，越来越多的证据表明，炎症会影响tau蛋白磷酸化。如TNF-α、IL-1β、白细胞介素-18(IL-18)等被证明与tau蛋白磷酸化有关[60]。IL-1β能够调控p38MAPK、GSK-3β, 进而影响tau磷酸化[61-62]。IL-18能调节N-甲基-D-天门冬氨酸水平，影响蛋白激酶引起tau蛋白磷酸化，并提高体内神经元tau蛋白的释放[63]。

研究[64-65]表明, Aβ能与脑内氧化氢酶相互作用，促使神经细胞的氧化应激和细胞凋亡加快，而tau蛋白能扩大Aβ引起的微管丢失，导致神经炎症等。胆碱能神经元活性异常也能导致Aβ的沉积和tau蛋白过度磷酸化[66]。新神经元和突触的形成以及中枢神经系统细胞的分化、成熟和存活在与神经生长因子有关，同时也与tau蛋白磷酸化存在密切联系[67]。

因此, OA脑内注射的动物模型，不仅能将与tau蛋白磷酸化有关的蛋白活性作为干预AD的疗效评价指标，也可针对不同AD假说进行相关蛋白浓度检测。

3 小 结

OA种类多样，常规OA不溶于水，需在DMSO、甲醇、乙醇中溶解才能使用，也有OA钠盐、OA铵盐能直接溶于水。当前研究的OA脑内注射的鼠种多为SD大鼠，按照脑立体定位图谱标准，模型鼠体质量需严格控制，因受雌激素对神经系统的影响，雄性鼠是首选模型复制对象。OA脑内注射部位多选双侧或单侧脑内海马、侧脑室; OA的注射剂量与浓度需根据动物耐受程度进行制备; 经OA脑内注射频次、手术后的行为学检测时间尚不统一; AD模型检测方法种类繁多，其中以Morris水迷宫应用最为广泛; OA脑内注射动物模型相关病理学检测应围绕tau蛋白磷酸展开。

综上所述，利用OA脑内注射建立的AD模型在行为学和形态学上与AD临床症状相似，且符合tau蛋白磷酸化改变的AD发病机制。本文将相关实验的造模条件进行总结，为今后tau蛋白磷酸化为特征的AD模型建立和机制的研究、干预手段等提供理论依据和实验参考。但OA脑内注射建模方法仍存在相应问题，不同的实验室在OA的使用剂量、给药部位、时间以及频次等方面存在差异，多次注射OA和一次性OA注射产生的模型结果是否存在差异，需进一步研究。为更贴近临床AD患者病理特征，研究采用OA联合其他AD造模方法建立AD动物模型，除研究机制存在一定差异外，认知功能无明显差异。临床上相关研究仍然较少，需要进行进一步研究。