水分活度对黑根霉生长的影响

王杠杠，王似锦，马仕洪

（中国食品药品检定研究院·化学药品质量研究与评价重点实验室，北京 100050）

水分活度（Aw）对于评价药品中微生物污染和增殖的风险具有重要意义[1-4］。Aw是指在相同温度下，产品的蒸气压与纯水的蒸气压的比值乘以100，即为等效相对湿度[5］。1957年，澳大利亚科学家SCOTT提出影响微生物生长的是Aw而非水分含量，每种微生物都存在最低生长Aw，低于该限值微生物将不能生长[6］。20世纪80年代，美国食品药物管理局（FDA）在食品生产中采用Aw检测对微生物进行控制，《美国药典》（USP）第29版也于2006年8月正式颁布＜1112＞Aw测定在非无菌药品上的应用，指出测量非无菌药品的Aw有助于优化处方，提高防腐体系的抑菌效果，降低处方（尤其是液体、膏、乳液和霜）受微生物污染的风险，并收录了代表微生物的最低生长Aw[7］。近年来，国内报道了部分制药行业代表性微生物生长所需的最低Aw[8-12］。黑根霉（Rhizopus stolonifer，曾用名Rhyzopus nigricans）又名匍枝根霉，是导致物质腐烂变质的常见污染菌。20世纪40年代，有学者研究了环境湿度对黑根霉孢子萌发的影响[13］。USP＜1112＞中收录的黑根霉最低生长Aw为0.93，但黑根霉在低于该Aw的条件下仍可生长[14-15］。为验证USP＜1112＞中收录的黑根霉最低Aw的准确性，本研究中选取1株黑根霉标准菌株作为研究对象，分别于氯化钠、甘油、蔗糖调节的不同Aw条件下培养，并观察菌落变化，分析不同调节剂作用下Aw对黑根霉生长的影响。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

菌株：黑根霉（Rhizopus stolonifer）CGMCC 3.10。

试剂与培养基：氯化钠（美国Sigma公司，批号为SZBE0490V）；甘油（国药集团化学试剂有限公司，批号为20180401）；蔗糖（北京糖业烟酒集团有限公司，批号为20181011）；沙氏葡萄糖琼脂（SDA）培养基（美国BD公司，批号为7135844）；S-Pak滤膜（美国Millipore公司，批号为F7EA83802）。

仪器：Aqualab 4TE Duo型水分活度测定仪（Decagon Devices公司，准确度为±0.003）；BJ-2202S型电子天平（德国赛多利斯公司，精度为0.01 g）；NU-534-400S型生物安全柜（Nuaire公司）；INC821C复合型低温恒温培养箱（Yamato公司）。

1.2 方法

培养基制备：以氯化钠、甘油、蔗糖为调节剂，配制一系列不同Aw梯度的SDA培养基，灭菌，待培养基冷却凝固，测量温度为25℃时的Aw。参考USP＜1112＞表1[7］中黑根霉最低生长Aw，调节SDA培养基最高Aw为0.94，向下每个Aw梯度相差0.01。同时配制不加调节剂的SDA培养基作为对照组（control）。

孢子悬液制备与预培养：按2020年版《中国药典（四部）》[16］要求，制备104cfu/mL的黑根霉孢子悬液。无菌操作，将滤膜正面朝上，贴于未调节Aw的SDA培养基上，取2.5µL孢子悬液点植于滤膜中心位置，22.5℃温度下预培养24 h。

转移及观察：测量并记录预培养后的菌落直径，作为初始大小。将菌落连同滤膜转移至制备好的不同梯度Aw的SDA培养基上，置用甘油调节的相同Aw环境的密闭容器中，22.5℃温度下培养21 d，每天测量菌落直径（垂直测量2次，取平均值），观察并记录菌落变化。以菌落直径增长（mm）对培养时间（d）作线性图，绘制黑根霉菌落生长曲线。

2 结果

2.1 黑根霉最低生长Aw

黑根霉在氯化钠、甘油、蔗糖调节的不同Aw条件下的生长曲线见图1。氯化钠组，Aw＜0.93时黑根霉无生长迹象；Aw=0.94，0.93时，培养1 d菌落直径有小幅度增加，可能原因是滤膜转移时带有少量原培养基，为黑根霉生长提供养分，故时间不能作为该Aw条件下的开始生长时间。菌落直径自第2天停止增长，持续一段时间后再继续增长，此时黑根霉生长养分来源为转移后的培养基，为该Aw条件下的开始生长时间。甘油组与蔗糖组，在Aw较低时，黑根霉由原菌落中心部位开始生长，并非由原菌落菌丝直接向外扩张，故生长早期菌落直径无变化。甘油组，Aw＜0.87时黑根霉无生长迹象。蔗糖组，Aw＜0.86时黑根霉无生长迹象；Aw=0.87，0.86时，肉眼可见有生长活动，但生长菌落未超过原有菌落范围，故直径增长计为0（图2）。由此得到不同调节剂作用下黑根霉最低生长Aw，氯化钠组为0.93，甘油组为0.87，蔗糖组为0.86。与氯化钠相比，以甘油和蔗糖作为调节剂时，黑根霉可在更低Aw条件下生长。

2.2 Aw对黑根霉生长的影响

高于最低生长Aw的条件下，黑根霉经过一段时间的停滞期后，菌落直径基本呈直线增长，直至长满培养皿或试验结束。以开始生长时间（d）、产孢时间（d）、生长速率（mm/d）为指标，评价Aw对黑根霉生长的影响。黑根霉不同Aw条件下的开始生长时间及产孢时间见表1。可见，随着Aw的下降，黑根霉开始生长时间、产孢时间均推迟；Aw较高时，黑根霉通常于开始生长后第2～3天产孢；Aw越低，产孢时间较开始生长时间推迟越多，Aw低于一定程度时黑根霉不能产孢。甘油作为调节剂时，Aw＜0.89时黑根霉不能产孢；蔗糖作为调节剂时，Aw＜0.88黑根霉不能产孢。

表1 不同Aw条件下黑根霉开始生长时间和产孢时间Tab.1 Beginning growth time and sporulation time of Rhizopus nigricans under different Aw

取生长曲线开始生长后的部分进行线性拟合，所得斜率即为该生长条件下黑根霉的生长速率（mm/d）。由图3可见，氯化钠组生长速率在7～63 mm/d之间，甘油组与蔗糖组生长速率在1～63 mm/d之间。不同调节剂作用下、Aw对生长速率的影响基本一致，随Aw的降低而下降。氯化钠组和甘油组Aw与生长速率大致呈线性关系。蔗糖组在Aw=0.91时曲线出现明显拐点，Aw＜0.91时Aw对黑根霉生长速率的影响减弱。

图3 Aw对黑根霉生长速率的影响Fig.3 Effect of Aw on the growth rate of Rhizopus nigricans

3 讨论

图1及图3显示，随着Aw的降低，黑根霉开始生长时间、产孢时间均推迟，生长速率下降；黑根霉在不同调节剂作用下最低生长Aw分别为0.93（氯化钠）、0.87（甘油）、0.86（蔗糖），差异明显。其中，氯化钠组结果与USP＜1112＞结果一致，甘油组及蔗糖组结果更低。

USP＜1112＞结果源自1949年SNOW[13］的研究，其研究对象为环境分离菌株，培养基为浸泡过啤酒麦芽汁的明胶，干燥后接种黑根霉孢子，置用硫酸溶液调节的不同湿度的25℃密闭环境中培养，显微镜下观察孢子的萌发情况。与本研究中所使用的判断是否生长的标准及调节Aw的方式有区别。

2011年，AMIRI等[15］报道了在使用氯化钠调节培养基Aw的条件下，黑根霉孢子萌发所需Aw（最低为0.908）低于菌丝生长Aw（最低为0.936），与本研究中氯化钠组的结果一致。HOCKING等[14］使用葡萄糖和果糖调节培养基Aw，得到的黑根霉孢子萌发最低Aw为0.84。考虑菌丝萌发需要Aw环境更高，认为与本研究中蔗糖组的结果基本一致。

SNOW[13］通过调节环境湿度来调节Aw的方式，在实际产品生产及储存过程中需要较长的平衡过程。在食品及制药工业中，通常通过控制处方及工艺调节产品Aw，本研究中采用直接添加调节剂至培养基中，更贴近产品生产及储存的实际情况，对于控制黑根霉污染、防止产品腐烂变质更有参考意义。且Aw调节剂种类对黑根霉生长有较大影响，提醒生产企业在选择添加不同种类的Aw调节剂时应设定不同Aw标准，以更有效地降低药品微生物污染风险。