老年非创伤性股骨头坏死组织中Rap1-PI3K/Akt信号通路表达特点及作用

朱磊 顾一帆 康金平 韩士鼎 徐寰 周正新

(安徽中医药大学第一附属医院骨伤科，安徽 合肥 230001)

老年人出现股骨头坏死主要包括创伤性或非创伤性，其中非创伤性股骨头坏死所占比例超过80%〔1〕。非创伤性股骨头坏死的病理机制复杂，多数研究者认为股骨头内缺血是其主要病理基础，骨微血管内皮损伤可能是缺血的主要原因，但具体分子机制尚未明确〔2〕。Ras相关蛋白(Rap)1是具有多种生物学功能的Ras家族小分子G蛋白，与细胞迁移能力密切相关〔3〕。近年来研究发现，脂质过氧化损伤内皮细胞后，细胞中的Rap1能够提升微血管通透性，降低血管高渗透，减轻组织缺血〔4〕。磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶 B(Akt)信号通路是Rap1、血管内皮生长因子(VEGF)的共同下游因子，可能共同调节股骨头局部血流状态〔5〕。本研究探讨了老年非创伤性股骨头坏死组织中Rap1-PI3K/Akt信号通路表达特点及作用。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2019年4月至2020年7月安徽中医药大学第一附属医院收治的老年非创伤性股骨头坏死患者50例为非创伤性股骨头坏死组，男29例，女21例；年龄60～75岁，平均(67.29±5.30)岁；国际骨微循环研究协会(ARCO)分期：Ⅲb期15例，Ⅳ期18例，Ⅴ期17例。另收集同期老年创伤性股骨头坏死患者50例为创伤性股骨头坏死组，男27例，女23例；年龄60～76岁，平均(67.90±4.61)岁；ARCO分期：Ⅲb期14例，Ⅳ期16例，Ⅴ期20例。性别、年龄、ARCO分期在两组间比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。患者均符合中国医师协会2016年颁布的成人股骨头坏死临床诊疗指南中对股骨头坏死的诊断标准，接受手术治疗；未合并关节感染、糖尿病、全身系统性疾病；本研究经医院伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。

1.2主要试剂和仪器 鼠抗人Rap1、PI3K、Akt单克隆抗体，鼠抗人VEGF多克隆抗体均购于北京达科为生物技术有限公司；鼠抗人GAPDH多克隆抗体购于北京诺博莱德科技有限公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG购于北京沃卡威生物技术有限公司；PrimeScriptTMRT Master Mix试剂盒购于上海联迈生物工程有限公司；PCR仪购于杭州瑞诚仪器有限公司。

1.3方法

1.3.1标本取材 非创伤性股骨头坏死组取两个区域(坏死区、正常区)骨组织样本，创伤性股骨头坏死组取正常区域骨组织标本。生理盐水将骨组织标本洗涤干净后用手术剪刀剪碎，一部分组织用于苏木精-伊红(HE)染色和免疫组化染色，另一部分组织在液氮中研磨成粉状，分为2份，分别用于实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western印迹检测。

1.3.2HE和免疫组化染色 使用4%的多聚甲醛固定组织标本24 h，20%乙二胺四乙酸(EDTA)脱钙液(pH7.2)处理，隔日换液到能够切片为止，4 μm连续切片。进行HE染色和Rap1、VEGF、PI3K、Akt免疫组化染色。其中免疫组化染色使用鼠抗人Rap1、PI3K、Akt单克隆抗体及鼠抗人VEGF多克隆抗体为一抗，均为1∶300稀释；辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG为二抗，1∶500稀释。HE染色结果在100倍光学显微镜下观察，免疫组化染色在200倍光学显微镜下观察。结果判定：无着色(-)、淡黄色(+)、黄色或棕黄色()、棕褐色()。

1.3.3qRT-PCR检测Rap1、VEGF、PI3K、Akt mRNA表达 氯仿和异丙醇提取骨粉中的总RNA，使用核算定量仪测定浓度、纯度，取其中1 μg RNA逆转录为cDNA。由上海联迈生物工程有限公司中国设计并合成Rap1、VEGF、PI3K、Akt基因上下游引物，GAPDH为内参基因。Rap1上游引物：5′-CATATTTAGGGAGTAACGACA-3′，下游：5′-CATCCCTTCCTTTGTCCAGTG-3′。VEGF上游引物：5′-TCGTTACAGGACTTGCAGGG-3′，下游：5′-AGTGGACGAAGACGTCTAAC-3′。PI3K上游引物：5′-GTTACTCCGGTCTCGCTAGA-3′，下游：5′-CTACGGGAAGACTTGACCGT-3′。Akt上游引物：5′-GTTACTCCGGTCTCGCTAGA-3′，下游：5′-CTACGGGAAGACTTGACCGC-3′。磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)上游引物：5′-AAGTAACACGACCCACGGT-3′，下游：5′-ACGAGATCCGCTGATACTGAATC-3′。按照产品说明书配制PCR液体20 μl，扩增条件：94℃预变性30 s，95℃变性5 s，50℃复性30 s，共40个循环。检测目标基因相对表达量。

1.3.4Western印迹检测Rap1、VEGF、PI3K、Akt蛋白表达 预冷的细胞蛋白裂解液在冰上充分理解骨粉30 min，4℃ 12 000 r/min离心10 min，将上清液转移至新离心管，BCA法蛋白定量，之后进行蛋白变性处理。配制10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，按照每孔蛋白30 μg上样后进行SDS-PAGE，将分离出的蛋白电转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，室温下封闭、洗膜，加入鼠抗人Rap1、PI3K、Akt单克隆抗体，均为1∶1 000稀释，鼠抗人VEGF多克隆抗体(1∶500稀释)，鼠抗人GAPDH单克隆抗体(1∶1 000稀释)，4℃过夜，洗涤后加入辣根过氧化物酶标记二抗(1∶5 000稀释)，室温摇床孵育2 h，化学放光法成像，使用Image进行灰度分析。

1.4统计学方法 采用SPSS25.0统计学软件进行方差分析和t检验。

2 结 果

2.1老年非创伤性股骨头坏死与创伤性股骨头坏死不同区域HE染色 非创伤性股骨头坏死区域软骨细胞数量明显减少，软骨下骨小梁增厚、断裂，细胞核消失，出现软骨陷窝，周围新生毛细血管和纤维母细胞等肉芽组织长入坏死组织，出现肉芽组织增生。非创伤性股骨头和创伤性股骨头坏死组骨组织正常区软骨细胞未发生明显病理学改变。见图1。

图1 非创伤性股骨头坏死与创伤性股骨头坏死组组织(HE染色，×100)

2.2Rap1、VEGF、PI3K、Akt表达的免疫组化 Rap1、VEGF、PI3K、Akt在非创伤性股骨头坏死组组织坏死区域、非创伤性股骨头坏死组组织正常区域、创伤性股骨头坏死组组织正常区域均呈阳性表达，其中非创伤性股骨头坏死组组织坏死区域Rap1、VEGF、PI3K、Akt表达强度()弱于非创伤性股骨头组患者组织正常区域()、创伤性股骨头坏死组组织正常区域()，而非创伤性股骨头坏死组组织正常区域、创伤性股骨头坏死组组织正常区域的Rap1、VEGF、PI3K、Akt表达强度相似。见图2。

图2 老年非创伤性股骨头坏死与创伤性股骨头坏死不同区域Rap1、VEGF、PI3K、Akt表达(免疫组化，×200)

2.3Rap1、VEGF、PI3K、Akt mRNA和蛋白表达 非创伤性股骨头坏死组骨组织坏死区的Rap1、VEGF、PI3K、Akt mRNA和蛋白表达水平明显低于非创伤性股骨头坏死组骨组织正常区、创伤性股骨头坏死组骨组织正常区(P<0.05)；Rap1、VEGF、PI3K、Akt mRNA和蛋白表达水平在非创伤性股骨头坏死组骨组织正常区与创伤性股骨头坏死组骨组织正常区之间差异无统计学意义(P>0.05)。见表1和图3。

表1 两组不同骨组织取材区域Rap1、VEGF、PI3K、Akt mRNA和蛋白表达水平比较

1～3：非创伤性股骨头坏死组坏死区域、非创伤性股骨头坏死组正常区域、创伤性股骨头坏死组正常区域图3 Western印迹检测各组不同骨组织取材区域Rap1、VEGF、PI3K、Akt蛋白表达

3 讨 论

非创伤性股骨头坏死的发病机制目前仍未完全阐明，可能与骨髓微血管内皮细胞和骨细胞损伤，引发骨细胞、骨组织坏死有关〔6〕。人体股骨头组织中的血液供应主要由股深动脉及其分支承担，提供所需的营养成分〔7〕。股深动脉的走行结构为上下支持带垂直穿入股骨头内部，该特殊角度容易导致血流中断，当血管内皮受到侵袭后会激活血管中的凝血机制，加速血栓形成〔8〕。股骨头组织血管中血栓形成与血管内皮损伤明显相关，其中非创伤性股骨头坏死与直接损伤骨髓微血管内皮细胞有关〔9〕。作为内皮细胞特异性的有丝分裂原，VEGF在新生血管形成中发挥重要作用。VEGF参与调控低氧诱导因子-1、PI3K/Akt等多个信号通路，而上述信号通路均与缺血缺氧所致的股骨头坏死有关〔10〕。进一步研究发现，血管内皮损伤后纤维蛋白大量进入血液，凝血系统被激活，出现血栓，引发股骨头缺血性坏死〔11〕。目前老年非创伤性股骨头坏死患者股骨头微血管内皮受损后难以修复的问题仍困扰临床。

研究者对Rap1在肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭中作用的研究为解决非创伤性股骨头坏死患者股骨头微血管内皮修复问题提供了思路〔12〕。Rasa3能够调控血管内皮的完整性、黏附性，当Rasa3消耗完后会减少黏附物质的周转，黏附物质主要以血管内皮细胞钙黏连蛋白为基础，降低内皮细胞间的黏附能力〔13〕。Rap1还能够使VEGF相关的内皮细胞通透性增加，在内皮屏障动态调节中发挥重要作用〔14〕。因此，可推测Rap1水平下降后无法及时有效地修复股骨头中的受损血管内皮，造成血栓持续处于高水平，引发股骨头坏死。

本研究说明非创伤性股骨头坏死区域血管内皮受损，且无法得到有效修复。Rap1、VEGF、PI3K、Akt低表达可能参与了老年非创伤性股骨头坏死的发生与发展。本文提示股骨头坏死部位Rap1合成量减少，无法有效修复股骨头中受损的血管内皮，造成VEGF合成、分泌量下降，抑制了新生血管形成，进一步加重了血管内皮损伤。同时Rap1、VEGF低表达也会降低内皮细胞的黏附、迁移能力，老年非创伤性股骨头坏死的发生与发展可能与内皮细胞的黏附、迁移能力下降有关。

PI3K/Akt信号通路是人体细胞中激活频率最高的通路之一，也是Rap1、VEGF的共同下游因子，在细胞凋亡、骨代谢、血管新生等生理过程中发挥重要作用〔15〕。Akt磷酸化后激活下游内皮型一氧化氮合成酶，增加重组人PIM-1蛋白表达，促进一氧化氮分泌，达到局部血管扩张作用〔16〕。目前Rap1-PI3K/Akt信号通路在股骨头坏死中的作用仍缺少相关研究报道，非创伤性股骨头坏死的发生可能与该信号通路密切相关。综上，Rap1-PI3K/Akt信号通路激活受限导致了老年非创伤性股骨头坏死的发生与发展。