雷公藤红素改善阿尔茨海默病大鼠学习能力的作用机制

邵亚 李红

(1甘肃省中医院，甘肃 兰州 730050；2深圳市罗湖区中医院)

阿尔茨海默病(AD)是一种神经系统退行性疾病〔1〕，其病理改变当下流行的观点认为是β-淀粉样蛋白(Aβ)沉积导致老年斑形成、神经纤维缠结及广泛神经元缺失〔2〕。自噬是一种重要的蛋白质降解途径，病态的自噬功能将会促进细胞内Aβ的生成。自噬缺陷发生在AD的早期，自噬启动，特征蛋白Beclin-1和LC3-Ⅱ将显著性地增长〔3,4〕。本实验观察雷公藤红素(Qu)干预下的AD大鼠模型学习记忆能力的提高及特征性自噬蛋白Beclin-1和LC3-Ⅱ的变化、神经系统变性疾病中有毒蛋白Aβ、p-Tau的表达变化，来探索Qu治疗AD可能的机制是通过调节细胞的自噬途径来实现。

1 材料与方法

1.1实验动物与分组 购自甘肃中医药大学科研实验中心120只SPF级Wistar大鼠，体重为(250±10)g。从中分出20只为对照组，双侧海马给予同等剂量的生理盐水代替造模药物。剩下100只，采用Aβ1～42至大鼠双侧海马构建AD模型，造模后随机分为5组(AD模型组、Qu高、中、低剂量组、雷帕霉素组)，实验室饲养，规律昼夜光照。

1.2试剂与药物 Qu(南京泽朗医药科技有限公司，批号：209B021)；雷帕霉素(索莱宝公司，批号：412H031)；Aβ1～40抗体(Bioss，批号：AG10091626)；Beclin 1抗体(Abcam公司，批号：GR 3198372-7)；Phospho-Tau(Bioss，批号：AE121775)；Beta-Amyloid(ANASPEC PEPTIDE，批号：1855817)；兔SP试剂盒(中杉金桥，批号：SP9001)。

1.3造模与给药 浓度10%的水合氯醛(4 ml/kg)麻醉大鼠，用鼠脑立体定位仪，体位保持门齿钩平面低于耳间线平面约2.4 mm，前后卤处相同平面。将大鼠的头顶部位去毛备皮并消毒，从头颅中线开颅，对照Paxinosand Waston，脑立体定位仪确定前囟后3.3 mm，中线双侧旁开2.0 mm的位置为双侧海马CA1区，用牙科钻钻开骨窗，膜下2.8 mm，以0.5 μl/min的速度缓慢注入Aβ1～42溶液5 μl，保持5 min，充分弥散，撤针，缝合，在缝合处滴注0.2 ml庆大霉素防止大鼠被感染。将对照组大鼠进行同样的手术操作，使用同体积的生理盐水代替造模所用Aβ1～42溶液。在造模后的次日直至第25天，配制Qu 0.5 mg/ml、1.0 mg/ml、2.0 mg/ml浓度试剂，按1.0 mg/(kg·d)剂量分别腹腔注射于Qu低、中、高剂量组，每日9～10点给药。同时雷帕霉素组配制溶液为1.0 mg/ml试剂，按1.0 mg/(kg·d)剂量，每日同时间腹腔注射，而对照组则给予等剂量的生理盐水每日腹腔注射。

1.4取材及组织处理 每组选择一半大鼠，分离双侧海马用于苏木素-伊红(HE)染色分析和海马Aβ、p-Tau表达免疫组化测定；剩余的一半，分离双侧海马用于Beclin-1、LC3-Ⅱ表达Western印迹检测。 10%水合氯醛(3 ml/kg)麻醉，0.01 mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)200 ml灌注冲洗血管床约20 min，直至流出液体清亮，4%多聚甲酸灌注30 min，切取包含海马的脑组织。4%多聚甲醛固定48 h，常规石蜡包埋，切4 μm的切片，附于防脱载玻片，6℃烤箱过夜干燥用于免疫组化(SABC)方法分析海马各亚区中Aβ1～40、p-Tau的表达量。冰上分离海马，液氮保存，随后转至-80℃冰箱保存，用于Western印迹检测。

1.5指标与检测方法 利用Morris水迷宫测试各组大鼠学习记忆能力。制作脑组织海马HE染色切片，用Olympus显微图像分析系统观察和分析大鼠海马结构、神经元形态和免疫组化阳性细胞。HE染色后的细胞不同结构的颜色和形态分别为：细胞核核仁呈现蓝色，细胞质呈淡红色，调亡细胞形态为细胞核肿胀、核仁颜色变淡，细胞核模糊，细胞排列松散。免疫组化法观察大鼠海马结构内各亚区神经元Aβ1～40和p-Tau蛋白的阳性表达情况，阳性结果：在胞质区域呈现棕黄色；细胞核呈蓝色。计算表达率：图像采集后使用 Image-Pro Plus6.0 图像分析软件计算出图像中阳性染色的平均光密度值。Western印迹法测定海马中蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ表达量。

1.6统计学方法 采用SPSS22.0软件进行方差分析，组间两两比较釆用LSD-t检验。

2 结 果

2.1Morris水迷宫检测各组学习记忆能力改善的比较 实验各组大鼠随着时间的延长，逃避潜伏期均呈现逐渐减少趋势。组间两两比较，与AD模型组相比，第1天训练成绩只有对照组有差异(P<0.05)，余各组均无明显差异；第2、3、4，5天训练成绩只有Qu低剂量组无明显差异，余各组均有明显差异(P<0.05)。Qu各组随药物剂量增加，学习记忆能力改善明显，且雷帕霉素组优于雷公藤红素各组(P<0.05)。空间探索试验 Morris水迷宫训练4天后，第5天开始撤出平台开展对大鼠空间探索能力的测试，结果显示：与对照组相比，AD模型组有效区域滞留时间和有效区域滞留时间百分比、逃避平台滞留时间显著缩短(P<0.05)；与AD模型组相比，Qu高、中、低剂量组、雷帕霉素组有效区域滞留时间和有效区域滞留时间百分比、逃避平台滞留时间明显延长(P<0.05)。Qu高、中、低剂量组有效区域滞留时间和有效区域滞留时间百分比随着剂量减少而减少，雷公藤红素高、中、低剂量组有效区域滞留时间和有效滞留时间百分比的平均值、逃避平台滞留时间均低于雷帕霉素组。见表1。

2.2形态学观察及HE染色 对照组大鼠海马CA区细胞大鼠形态如U形，与此相对可见V形齿状回，所见组织结构清晰，见图1。AD模型组可见CA 区神经元显著丢失，锥形细胞呈松散排列，部分细胞核仁不清，细胞核肿胀模糊，正常体积的锥形细胞明显减少；对照组神经元细胞饱满、锥形细胞呈紧密排列，核仁染色清楚，细胞核轮廓清晰，体积正常，均匀一致。Qu高剂量组、雷帕霉素组与AD模型组比较海马组织病理学显著改善，Qu低剂量组、Qu中剂量组与AD模型组比较海马组织病理学改善不显著，见图2。

表1 各组5 d逃避潜伏期、有效区域的滞留时间、百分比比较

2.3海马中蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ表达 AD模型组Beclin-1、LC3-Ⅱ表达量显著低于对照组，Qu高、中、低剂量组、雷帕霉素组显著高于AD模型组(均P<0.05)，其中Qu的各剂量组随着药物剂量的增加，海马中Beclin-1、LC3-Ⅱ表达量逐渐增加。雷帕霉素组优于Qu各组。见表2、图3。

2.4免疫组化测定海马Aβ1～40、p-Tau表达 AD模型组海马Aβ1～40、p-Tau表达量显著高于对照组，Qu高、中、低剂量组、雷帕霉素组海马Aβ1～40表达量显著低于AD模型组(均P<0.05)。其中Qu的各剂量组随着药物剂量的增加，海马Aβ1～40、p-Tau的表达量逐渐减少。雷帕霉素组优于雷公藤红素各组。见表2。

图1 对照组海马CA区组织结构(HE染色，×40)

图2 各组海马CA3区神经元形态(HE染色，×200)

表2 海马中蛋白Beclin-1、LC3-II、Aβ1-40、p-Tau表达值)

1～6:AD模型组、对照组、Qu低剂量组、Qu中剂量组、Qu高剂量组、雷帕霉素组图3 各组大鼠海马内自噬相关蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ的表达

3 讨 论

AD主要病理学改变为大脑尤其是海马区组织的萎缩、Aβ沉积形成的老年斑(SP)、Tau 蛋白过度磷酸化形成的神经元纤维缠结(NFT)及选择性神经元丢失等〔4，5〕。关于AD的发病机制目前尚不完全清楚，只是存在多种假说，包括Aβ毒性学说、Tau 蛋白异常修饰学说、氧化应激学说、基因突变学说、脂代谢紊乱学说、炎症学说和胆碱能损伤学说等〔6，7〕。尽管国内外学者对AD的研究深入持续多年，但目前尚未对AD的罹患原因在机制方面有明确的结论〔8～10〕。中医是我国的传统医学，有着自己独特的诊疗体系及思维，随着对中医药治疗AD的研究深入，单味药物，复方制剂在临床中的运用比比可见，而且大量学者对单味中药及复合中药方剂的药理作用做了大量的动物实验，力图从中发现中药及中药方剂的有效成分及治疗AD的作用机制。本研究进一步表明AD可能与自噬机制相关，Qu可能是通过调节自噬机制来改善AD的记忆学习障碍，但AD的发生机制尚不完全明确，多环节，多层系性，极其复杂，所以Qu干预AD大鼠模型的机制尚不完全明确，仍需广泛和深入的研究。