LC-MS法测定人血清中泼尼松的浓度

闫 晗，刘 颖，杨巧芝，吕学云，秦 媛，秦道刚，刘培漫，王 婷

(聊城市人民医院中西医结合儿科重点实验室，山东 聊城 252000)

泼尼松广泛应用于肾病综合征(nephrotic syndrome，NS)[1-4]、甲状腺炎[5]、皮肤病[6]和红斑狼疮[7]的治疗，其临床给药方案通常凭医生经验制定。在进行冲击治疗和长期给药时往往带来股骨头坏死、高血压、高脂血症、糖尿病、骨质疏松症、柯兴综合征和儿童发育迟缓等多种毒副作用[8]。因此，需要建立快捷、方便的泼尼松血药浓度检测方法，为泼尼松个体化用药的相关研究奠定基础。国内关于泼尼松生物样本中浓度测定方法为高效液相色谱法[9]，但测定所需时间较长。国外文献报道关于生物样品中泼尼松的测定方法主要有高效液相串联质谱法(LC-MS)和气相色谱串联质谱法(GC-MS)。样品处理方法多为固相萃取法，预处理方法耗时且生物样品用量较大[10]。本研究采集4名肾病综合征患儿服用泼尼松后的血清样品，使用LC-MS法进行血药浓度检测，建立了一种简便、快速、准确的测定人血清中泼尼松浓度的LC-MS法。

1 仪器与材料

AB Sciex 4500 Qtrap质谱仪，岛津液相色谱仪(包括LC-20AD泵2台、DGU-20A3R在线脱气仪、SIL-20AHT自动进样器、CTO-20A柱温箱)，EPPENDORF 5424R型高速冷冻离心机，万分之一电子分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)，EPPENDORF系列微量移液器：10～1000 μL。

泼尼松(中国药品生物制品检定所，批号100199-201002，纯度98.50%)，卡马西平(中国食品药品检定研究院，批号100142-201105，纯度99.70%)，甲醇(色谱级，赛默飞世尔科技有限公司)，乙酸乙酯、甲酸(色谱级，阿拉丁试剂有限公司)，水(纯净水，杭州娃哈哈集团有限公司)。

2 方法与结果

2.1 色谱及质谱条件

色谱柱：Poroshell 120 SB-C18色谱柱(2.1 mm×50 mm，2.7 μm)；流动相：甲醇(0.05%甲酸)-水(0.05%甲酸)(50:50),流速为0.3 mL/min，进样量为2 μL，柱温为40 ℃。离子源为电喷雾离子源(ESI源)，正离子方式检测，喷雾电压为5.5 kV；Gas1(N2)∶50 Arb，Gas2(N2):50 Arb。DP分别为50 eV(泼尼松)和115eV(卡马西平)；EP分别为10 eV(泼尼松)和4 eV(卡马西平)；CE分别为31 eV(泼尼松)和42 eV(卡马西平)；CXP分别为9 eV(泼尼松)和13 eV(卡马西平)；扫描方式为选择反应监测(MRM)。用于泼尼松定量的离子对为m/z359.1/237.2，用于卡马西平定量的离子对为m/z237.9/194.1。

2.2 标准溶液的配制

精密称取泼尼松对照品10 mg置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解定容成泼尼松储备液。以上储备液于4 ℃冰箱内储存。临用时将储备液用甲醇稀释成所需浓度，即得泼尼松系列标准溶液。精密称取卡马西平对照品，用甲醇溶解并稀释至浓度为1 mg/L的内标溶液。

2.3 血清样品的处理

取血清200 μL置于1.5 mL EP管中，加入20 μL内标溶液和20 μL甲醇，加入乙酸乙酯800 μL混匀并涡旋5 min，15 000 r/min离心5 min，取上清置另一EP管中，35 ℃氮气流吹干。100 μL流动相溶解残渣，涡旋振荡5 min，15 000 r/min离心5 min，进样2 μL分析。

2.4 方法专属性

泼尼松在ESI正离子电离方式下，主要生成[M+H]+离子峰，为m/z359.1。选择性对[M+H]+离子进行产物离子全扫描质谱分析。泼尼松生成的主要碎片离子为m/z237.2，将此主要碎片离子作为定量分析时监测的产物离子。见图1。

取人空白血清200 μL，按“2.3血清样品的处理”项下的方法操作，进样2μL记录空白血清样品的色谱图(A)；将一定浓度的泼尼松标准溶液和内标液加入空白血清，依同法操作，得模拟血清样品色谱图(B)；取肾病综合征患者口服泼尼松后4 h的血清样品，依同法操作，得血清样品色谱图(C)。结果表明，在上述色谱条件下，内源性物质和代谢物不干扰血清中各成分的测定。泼尼松和内标卡马西平的保留时间分别为为1.69 min和1.74 min,见图2。

2.5 标准曲线

取正常人空白血清200 μL，加入泼尼松系列标准溶液20 μL，制成相当于泼尼松10.0、20.0、40.0、80.0、160.0 μg/L的模拟血清生物样品，按“2.3血清样品的处理”项下的方法操作，每一浓度进行双样本分析，进样2 μL，记录色谱图。以血清中待测物浓度(μg/L)为横坐标(X)，待测物的峰面积为纵坐标(Y)，用加权(w=1/x2)最小二乘法进行回归运算，所得的直线回归方程为

y=3.706×103x-1.233×103(r=0.998 3)

2.6 精密度与准确度

取正常人空白血清200 μL，按“2.5标准曲线”项下的方法制备成低、中、高三个浓度(泼尼松10、40、160 μg/L)的QC样品，每一浓度进行6样本分析，连续测定3 d，根据当日的标准曲线，计算QC样品的浓度。对测定结果进行分析，考察方法的日内与日间精密度RSD与准确度RE。结果见表1。表明方法的精密度与准确度良好，符合生物样品测定的相关要求。

表 1 泼尼松的精密度和准确度(n=6)

2.7 提取回收率

取正常人空白血清200 μL，按“标准曲线和定量下限”项下方法操作，制备低、中、高3个浓度(10、40、160 μg/L)的QC样品，每一浓度6样本分析，按照“2.3血清样品的处理”项下的方法操作，记录被测物的峰面积A，另取正常人空白血清200 μL，除不加甲醇和内标溶液外，其余按照“2.3血清样品的处理”项下方法处理。向获得的上清液中加入标准溶液20 μL和内标溶液20 μL，并在35 ℃氮气流吹干后再加起始比例流动相100 μL溶解，涡旋离心后取上清液进样分析，记录被测物的峰面积B。以每一浓度QC样品的峰面积A与未经提取的样品峰面积B均值的比值计算，验证方法的提取回收率，同法考察内标物的提取回收率。结果见表2。

2.8 基质效应

取标准溶液20 μL和内标溶液20 μL，置EP管中，35 ℃氮气流吹干后加起始比例流动相100 μL溶解，涡旋混合，离心后取上清液进样分析，每一浓度6样本，记录被测物的峰面积C。以“提取回收率”项下方法所得的峰面积B与峰面积C均值的比值计算泼尼松的基质效应，同法考察内标物的基质效应，结果见表2。表明本方法无明显基质效应。

表 2 泼尼松和卡马西平的基质效应和提取回收率(n=6)

2.9 样品稳定性

取正常人空白血清200 μL，按“2.5标准曲线”项下的方法制备成低、中、高三个浓度(泼尼松10、40、160 μg/L)的QC样品，照“2.3血清样品的处理”项下的方法操作每一浓度进行3样本分析，考察血清样品-20 ℃冻藏的稳定性。另采用“2.6精密度与准确度”项下样品，考察预处理后的样品溶液进样器放置24 h的稳定性。结果表明，泼尼松在上述条件下稳定性良好(RE在-7.20%～9.47%)。

2.10 方法学应用

泼尼松治疗儿童肾病综合征常与其他药物联合用药。本实验收集的4例肾病综合征患儿均为联合用药(依那普利、钙片和骨化三醇)。肾病综合征患者于早上按2 mg/kg的剂量服用泼尼松后2 h和4 h分别取上肢静脉血2 mL，离心分取血清，-20 ℃保存待测。LC-MS法测定血清中泼尼松的含量，重复性较好，结果见表3。

表 3 肾病综合征患者口服泼尼松后的血药浓度

3 讨 论

文献报道，NS患者服用泼尼松0.5 h后，血中可检测出泼尼松，2 h左右达到峰值，2 h后泼尼松浓度开始下降[9]。本实验测定4例NS患者泼尼松浓度，其结果与文献报道相近[9]。

本实验建立LC-MS法测定人血清中泼尼松浓度的方法，较文献[9]方法有较高的灵敏度且快速、准确，适用于临床上对人血清中泼尼松的测定。通过优化色谱条件，采用甲醇(0.05%甲酸)-水(0.05%甲酸)(50∶50)等度洗脱，泼尼松能够产生较大响应的[M+H]+，且峰形良好，色谱峰保留时间短。分别考察了乙酸乙酯和正己烷作为萃取剂进行液液萃取的血清样品处理方法，液液萃取法对血清样品净化能力较好，内源性物质干扰减小，正己烷液液萃取，泼尼松回收率低，故最终采用乙酸乙酯作为血清样品提取溶剂。采用乙酸乙酯一步萃取，内标法测定血药浓度，减少了操作步骤，降低了误差，使操作简便，易于标准化，有较高的临床实用价值。