白酒酿造微生物的生物多样性归纳分析研究

马 楠

（西南民族大学食品科学与技术学院，四川 成都 610041）

白酒酿造过程中，微生物在酒曲、酒醅、窖泥中参与了淀粉或糖质的糖化、发酵、产酯生香过程，因此微生物的生态分布情况、种群结构状态和代谢消长过程直接影响发酵结果。同时，与风味功能有关的微生物结构决定了白酒的酿造质量和香气类别，是影响白酒香型的关键。深入研究白酒中微生物的多样性可以更好地对白酒酿造技术进行创新，提高白酒的酿造品质、产量等。

我国进入农耕时代较早，掌握了多种粮食种植技术。大部分地区的气候为夏雨冬干。夏季的雨量较为集中且温度较高、湿度较大，能够给微生物提供较为适宜的生长环境。每年从6 月6 日到7 月19 日，我国南方大部分地区处于梅雨季节，此时间段内酿酒所用的粮食水果等原料中更容易产生霉菌，气候、湿度、温度等自然条件均适合微生物的生长，有利于人们成功酿造出各类美酒。

现阶段，相关学者通过现代生物技术对白酒酿造过程中涉及的微生物情况进行了详细的研究。陈雪等对凤香型白酒中的微生物进行了研究，发现该种香型的白酒共含有细菌182 种，真菌32 种，且乳酸杆菌的种群数量占绝对优势；详细分析了白酒理化因子与微生物多样性之间的关系，研究证明细菌多样性和温度之间呈负相关，还原糖和淀粉之间呈正相关的关系。崔凤娇等对芝麻香型白酒中的微生物多样性进行了研究，发现在发酵前期，白酒中的优势菌属为芽孢杆菌，发酵后期，优势菌属变成了乳杆菌，其次才是芽孢杆菌；在酵母方面，伊萨酵母为优势菌群，其次为假丝酵母和酿酒酵母。

本文以现有研究成果作为基础，从酒曲、酒醅、窖泥3 个方面分析多种香型白酒酿造过程中的微生物多样性，总结出微生物多样性与理化指标之间的关系，并将该关系应用于多种酿酒工艺中，进一步提高白酒的产量和品质。

1 多香型白酒酒曲微生物多样性分析

曲最早指的是发霉的谷物种子，经过不断地改良逐渐形成了“曲衣”的说法，指的是含有霉孢子的粮食曲。酒曲在发展初期，微生物种类还较为单一，主要以米曲霉为主，其次为酵母菌。汉代后饼曲逐渐流行，饼曲能够繁殖出的微生物种类更多，使得微生物组成也更加丰富，更具多样性，此时酒曲中酵母菌也逐渐增多。后来酿酒者在酒曲中加入了一些草本植物使得各菌群的维生素营养更充分，生成也更为旺盛，也就逐渐形成了现阶段边糖化边发酵的复式发酵工艺。

微生物对脂肪和蛋白质分解及其自身代谢而产生的分解物会影响酒曲中微生物的多样性。与高等生物相比，微生物的地域分布特征不明显，但是更容易随着气流运动。因此酒曲中微生物大多数来源于酿造环境、保温芦苇等，或者是由各种酿造原料带入的，主要以细菌和酵母菌为主。

从浓香型、酱香型、清香型3 种香型白酒的酿造过程出发，总结酒曲中微生物的变化情况。经过归纳研究分析，三者酿造环境中的微生物种类大致相同，但由于制曲工艺和酿造原料的不同，酒曲中的微生物种类存在细微差异。

2.1 浓香型白酒酒曲微生物分析

对现阶段最为大众所熟悉的浓香型白酒——泸州老窖的酒曲微生物进行研究。常用的方法有克隆文库方法单独分析成品酒曲微生物组成，也可以与其他方法相结合研究酒曲不同位置细菌和真菌组成的差异。与传统的研究方法相比，克隆文库可以获得更加丰富的多样性信息。

据研究报道，将泸州老窖同一批次质量不同的3 种高温大曲，根据颜色由深到浅分别记为F1、F2、F3。该酒厂夏天浓香型白酒生产堆积的时间是32 h 左右，在堆积过程中跟踪取样。取样时从两端及中间取样并混匀，并记录取样时的温度。观察样品酒曲在发酵过程中各微生物的消长变化情况如下：

样品酒的酒曲中根霉较多，曲霉次之，优质曲中红曲霉也相对较多。这是因为泸州老窖的酒曲配置温度最高不超过55 ℃，因此霉菌和酵母菌存活率较高，酒曲中两种菌属的含量也就相对较高。

2.2 酱香型白酒酒曲微生物分析

酱香型白酒主要选取酱香高温大曲进行研究。研究方法与浓香型白酒相同。酒曲在发酵过程中微生物变化情况如下：

酱香高温大曲中除了存在根霉、曲霉两种霉菌以外，还存在少部分耐高温霉菌，细菌数量占优势，大致有97.6%，霉菌占据2.3%，而酵母菌不容易被检测出来。

这是因为高温制曲是制作酱香型白酒的主要技艺，在其酒曲制作过程中微生物生长会释放大量的热量，导致曲块的温度能够达到60 ℃以上，而大多数霉菌和酵母菌在如此高的温度下都难以存活，因此酱香高温大曲中霉菌和酵母菌的含量极少。

2.3 清香型白酒酒曲微生物分析

汾酒是清香型白酒的代表，因此以汾酒为例分析清香型白酒在酿造过程中酒曲微生物的变化情况，相关研究结果如下：

汾酒酒曲中的细菌分布情况与泸州老窖较为相似，均含有较多的乳酸菌、醋酸菌及芽孢杆菌。汾酒的酒曲配置温度最高不超过50 ℃，因此霉菌和酵母菌存活率较高，酒曲中两种菌属的含量也就相对较高。大曲样品中细菌和芽孢杆菌的数量较高，其中芽孢杆菌的数量较高，该种大曲的“穿衣”效果较为明显。大曲的“穿衣”一般是微生物尤其是霉菌生长好坏的外在表现特征，由于霉菌在生长繁殖过程中可产生糖化酶、液化酶、蛋白酶、纤维素酶等多种酶类，所以霉菌的生长繁殖状况对各种酶活力有很大的影响。

此外由于白酒酒曲大部分是靠天然接种培制的，往往也会存在一些不利于酿造的微生物，如上述3 种研究对象中均检测出了一些犁头霉，根据多年酿造经验可以判断该类霉菌会对酒的酿造质量产生一定的负面影响，例如：如果汾酒的酒曲中含有较多的犁头霉就会产生微弱苦味。

3 多香型白酒酒醅微生物多样性分析

酒醅的微生物区系较为复杂，是酿酒过程中研究微生物多样性的重要对象。在整个发酵过程中，微生物代谢形成的不同酶菌会引起一系列的生化反应，使得白酒形成不同风味，因此本文对不同风味白酒糟醅中的微生物进行分析。

现阶段，利用DGGE 指纹图谱可以比较直观的观察微生物菌落的变化，常结合图像分析软件，计算微生物群落的多样性指数及聚类分析。利用DGGE 研究酒醅微生物群落组成的变化，分析与微生物生长环境理化因子以及白酒质量相关的关键风味物质变化的关系，对于揭示白酒的酿造机理有十分重要的意义。

3.1 浓香型白酒酒醅微生物分析

通过现代生物学技术对浓香型白酒酒糟中的真核和原核生物进行研究。分析微生物生长、转化和分布情况后得出如下结论：大多数细菌都在上层酒醅中，只有酵母菌在底层的酒醅中，且霉菌在酒醅中含量较少。

白酒发酵初期，酵母菌、碱性厌氧细菌和霉菌的菌群数量会大幅度增加。随着发酵的不断深入，各类菌群数量均有所降低。发酵中期，细菌、酵母会逐渐成为优势菌群。发酵后期，酵母菌种总量减少，直至不能被检测出来，数量接近于零。而芽孢杆菌会逐渐增多。

通过对微生物16S rRNA 序列的同源性进行对比，发现糟醅中的原核生物主要是古细菌，如真菌、甲烷囊菌以及甲烷螺杆菌等。

有文献对现阶段最为大众所熟悉的浓香型白酒——泸州老窖进行研究。白酒窖内中层中心和周围的糟醅，在发酵过程中各细菌的消长变化情况如下：刚入窖时期，微生物的多样性较高，发酵7 d后细菌种类减少，且嗜酸乳杆菌成为优势菌群。发酵一个月时，散囊菌属与曲霉菌属代替了嗜酸乳杆菌成为优势菌群，实验前被认为大量存在的酵母属仅在发酵一周后的糟醅中层边缘处微量存在，这表明了酵母属在泸州老窖的酿造过程中不是主要菌属，这是因为泸州老窖在酿造过程中使用了回酒蒸馏技术，给嗜酸乳杆菌的大量产生提供了时机。

不同的酿造环境所产生的微生物也略有差异，与上文泸州老窖相似的浓香型酒——习酒和全兴酒的酒糟中也以乳杆菌为优势菌群，而宜宾多粮酒的酒糟中优势菌则有所不同，主要是以芽孢杆菌为主。此外全兴酒的优势菌群除了与泸州老窖相同的曲霉菌属、伊萨酵母菌群以外还有酵母菌属、犁头菌属以及复膜孢子酵母菌属。这是由于全兴酒多酿造于盛夏，所以在发酵初期检测到的优势菌多数为未培养菌以及通常分布于土壤中的魏斯氏菌属。

3.2 酱香型白酒酒醅微生物分析

酱香型白酒与浓香型白酒存在一定差异，酱香型白酒的酒醅表现在两个方面，分别为窖内发酵酒醅和高温堆积酒醅。酱香型白酒异于其他香型白酒的酿造工艺，使得酒醅中的微生物区系较为特殊，这也在一定程度上给微生物多样性的研究增加了难度。

酱香型白酒的高温制曲工艺导致大量酵母菌死亡。酒醅堆积的过程中，微生物又被网罗其中，再次增加了微生物的多样性。

据研究报道，酱香型白酒在酒醅堆积过程中，酵母菌的数量会快速升高，细菌的数量随之降低，且随着堆积轮次的增多酒醅中的总菌群数量会逐渐降低。在窖内发酵过程中，各类细菌和酵母菌都会不断减少。发酵后期，乳酸菌会逐渐减少，直至无法被检测出来。酱香型白酒的制曲温度一般在50 ℃左右，酒醅中的细菌也以中温嗜热菌为主，多为芽孢杆菌属，还有少量葡萄球菌属，酵母菌主要为假丝酵母、裂殖酵母属。

在酱香型白酒冬季生产过程中，堆积的酒醅内部或表层处会出现星白色或微黄色的团状物，一般带“霉味”，且酒醅干燥，下窖时酒精味较浓。这种现象称为“腰线”。有研究采用稀释涂布法对不同腰线酒醅样品的酵母与霉菌进行分离，培养基稀释度分别为10、10、10，于30 ℃恒温培养箱中静置培养。3 d 后按平板计数法对酵母菌计数,并对不同形态菌株进行分离与纯化。7 d 后，按同样方法对霉菌菌落计数与分离。实验发现在该过程中细菌数量和种类的比例有所下降，而酵母菌数量和种类的比例不断增多。窖内发酵初期细菌的总量下降，酒醅的中上层酵母菌减少。发酵中期，细菌数量会有小幅度的回升，下层的酵母菌数量会迅速增多，随后又缓慢降低。霉菌的数量在发酵初期慢慢减少，中期时会有所回升，之后基本保持稳定。

3.3 凤香型及清香型白酒酒醅微生物分析

汾酒为清香型白酒的代表，其生产过程实质为霉菌、酵母菌、细菌互相作用的结果。通过模拟汾酒的发酵过程发现其主要功能菌为细菌和酵母菌。乳酸乙酯是清香白酒的主要香气成分，其比例略低于乙酸乙酯。夏季温度升高时，酿酒环境中乳酸菌数量迅速增加，乳酸菌代谢产物——乳酸，经过酯化作用合成乳酸乙酯，导致乳酸乙酯和乙酸乙酯的比例失衡。

另外据有关报道，汾酒酒醅大米查、二米查中的菌群数量在发酵过程中出现了二次生长，但生长过程不完全一致。发酵初期时，大米查中的乳酸菌数量比二米查要多，还存在较少的霉菌，发酵至中期时，二米查的酵母数量多于大米查，发酵后期时大米查逐渐增多的微生物主要为细菌，而二米查中除了细菌变多以外酵母菌数量也逐渐上升。

在发酵过程中，微生物种群的变化情况凤型与清香型大致相同，存在差异的地方是凤香型白酒的酒醅中含有较多的放线菌，尤其是在发酵的中期和末期，糟醅中的数量最多。

4 白酒窖泥微生物多样性分析

来自操作环境、窖泥、酒曲等处的各种微生物在酒糟和窖泥中演变、迁徙、能量变换，形成了窖池的微生物区系。各区系达到平衡，意味着固态阶段发酵完成。

通过观察发现窖池中微生物的多样性和酿造环境的微生态有很大关系，微生物的多样性是窖池中微生态系统的一部分。酿酒物质的能量代谢与微生物的消长共同促进窖池的生态演变，因此分析酿酒窖池中微生物的多样性，能够给微生物工业应用提供可靠的数据支撑。

窖泥是酿造白酒过程中微生物的栖息环境，其中不同种类的微生物会不断演替代谢，在发酵的整个过程中会出现非常明显的多态性。窖泥中的环境也较为特殊，其乙醇含量较高，pH 值和氧含量较低，导致了微生物群落结构也更具多样性。窖泥是各功能菌的繁殖载体，直接与白酒香味的形成相关。张应刚等分别检测泸州老窖5 年、30 年、100年、300 年窖泥中的微生物后，结果表明，5 年窖龄的窖泥中优势菌属分别为根霉属、孢子菌属；100年窖龄的窖泥中优势菌属分别为曲霉属、假丝酵母属；300年窖泥中的古细菌主要是广域古菌，占总菌数的9.2 %～16.5 %；30 年的窖泥中广域古菌占总菌数的0.6 %，相较于300 年窖泥含量更低。30 年窖泥中的优势菌门为厚壁菌门，占总数的90 %以上，厚壁菌门中又以乳酸菌属为主，约占总数的92 %以上；而在300 年窖中厚壁菌门也为优势菌门，占比在43 %以上，也以乳酸菌为主，但是仅占总数的20 %左右。此外，30 年窖泥中还存在梭菌属和甲烷共生梭菌属，分别占总数的21 %和2.7%。300 年窖泥中也存在以上两种菌属，但是占比少，分别为2.5 %和0.36 %。从以上分析可以看出，年限不同的白酒窖泥微生物菌落结构也不同，而对于不同类型的白酒，窖泥微生物菌落结构也不同，在白酒窖泥微生物多样性分析中，汤沟白酒退化窖泥、普通窖泥、优质窖泥中的微生物菌落结构具有典型性。退化窖泥中的优势菌属为乳杆菌属；普通窖泥中的优势菌属为乳杆菌属、甲烷共生梭菌属等；优质窖泥中的优势菌属主要为乳杆菌属、梭状芽胞杆菌、甲烷共生梭菌属等。随着窖泥质量的提升，乳酸杆菌属的质量逐渐减少，梭状芽胞杆菌、类杆菌、甲烷诺杆菌等菌群逐渐增多，这就表明后3 种菌属能够在一定程度上提高窖泥质量。此外在分析的过程中还发现较高的乳酸含量和有机磷含量、低pH 值可能为窖泥质量发生退化的主要外因。

5 小结

在白酒酿造过程中酵母菌以酿酒酵母、生香酵母等参与发酵。其中酿酒酵母的产醇能力最强，生香酵母具有强大的糖化、酒化、产酯能力，能够增加酒醅中的酯类物质含量，使白酒呈现出不同的香味。

常见的细菌有乙酸菌、乳酸菌、丁酸菌、醋酸菌。乳酸菌会促进酿酒原料中的发酵糖类转化为乳酸，乳酸酯化后形成乳酸乙酯。乳酸乙酯为白酒产生香味的主要物质之一，但是若含量过高也会使酒体有闷头的口感。醋酸也是白酒的主要生香物质，但是含量过多会导致白酒中有刺激性酸味出现。乙酸菌和丁酸菌多分布在窖泥中，是生香物质乙酸乙酯和丁酸乙酯的前体。实际参与酿造的微生物还有很多，总体来说微生物的多样性越高，则白酒的口感就越为丰富，品质也就越高。因此，在酿酒的过程中需要严格控制以上几种酵母和细菌的含量，使白酒的品质和口感更佳。

本文对白酒酿造中微生物的多样性进行了归纳研究，以泸州老窖、茅台、汾酒等不同酿造环境下的白酒作为分析目标，分别阐述不同香型白酒酿酒微生物多样性的变化情况，总结出相关规律。若这些微生物的相关研究成果能实际应用于传统酿酒工艺中，必将能进一步提高白酒的酿造品质。