原子力显微镜观察细胞膜水通道AQP-3分布

樊 珍，王丽芳，王立伟，陈丽新，张海峰

(1西安市精神卫生中心心理科，陕西 西安 710061；2西安交通大学转化医学研究院遗传与发育研究所，陕西 西安 712000；3西安循证医药研究院，陕西 西安 710003；4暨南大学基础医学院生理学系，广东 广州 510632)

在机体发育、免疫应答、伤口愈合、肿瘤侵袭转移等过程中，细胞膜边缘形成的突起是驱动细胞移动的关键步骤[1-2]；在神经突起生长过程中，神经元胞体在特定部位形成的突起，亦是轴突和树突形成的关键[3-4]。突起依据形态特征可分为片状伪足和丝状伪足，片状伪足主要负责细胞爬行，而丝状伪足作为感受器主要负责探测外界信号。突起是细胞局部体积可控性增大的过程，在多种膜成分(包括水通道和离子通道)参与下，以微丝或微管骨架蛋白为结构基础的细胞变形过程[5-7]。示踪标记这些生物大分子，对研究突起形成机制具有重要意义。

原子力显微镜(atomic force microscope，AFM)是一种纳米级高分辨率的扫描探针显微镜，其纳米级探针固定在可灵敏操控的微米级弹性悬臂上，当探针与待测样品距离相当近时，探针顶端原子与样品表面原子间产生的作用力会使悬臂弯曲偏离原来的位置，依据探针偏离量或振动频率构建三维图像，就能间接获得样品表面形貌或原子成分[8]；扫描探针表面修饰生物活性物质，如抗体，或胶体金标记生物样本后再行探针扫描，可用来分析生物样本表面抗原特征等[9-11]。然而，通过商品化途径，获取可识别膜蛋白胞外段的单克隆抗体往往存在一定困难，且制备单抗过程复杂、周期长。因此，本实验拟以水通道3(aquaporin-3，AQP-3)为研究对象，通过构建AQP-3/血凝素(hemagglutinin，HA)标签融合载体，胶体金标记HA标签蛋白后，利用AFM分析AQP-3在细胞膜上的分布特征。

1 材料与方法

1.1 材料

细胞培养液RPMI 1640(31800-022)和新生牛血清(16010-159)购自美国Gibco公司，青霉素(P3032)和链霉素(S9137)购自美国Sigma公司。引物均由上海生工生物技术有限公司合成。XhoⅠ(XHO-101)和EcoRⅠ(ECO-111)限制性内切酶购自日本Toyobo公司，Pfu高保真酶(P2021)和KODDNApolymerase高保真酶(KOD-201)分别从中国东盛生物和日本Toyobo公司购买。HA标签小鼠单克隆抗体(AH158)购自中国碧云天公司，Alexa Fluor 405(A-31553)和10 nm胶体金(GA1004)标记的山羊抗小鼠抗体分别购自美国Invitrogen 公司和中国博士德生物公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 高分化鼻咽癌CNE-1细胞用含100 mL/L新生牛血清、100 IU/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的RPMI 1640培养液常规培养在50 mL/L CO2、37 °C的培养箱内。培养48 h，待细胞融合度达到90%以上，常规胰酶消化细胞至变圆，倒掉胰酶后加入适量新鲜培养液终止消化，吹打细胞使其成为单细胞悬液，将细胞悬液分至3个培养瓶中继续培养，或种植在细胞培养板中进行后续实验。

1.2.2 质粒构建 采用重叠聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)法将HA标签基因克隆到AQP-3的DNA序列中，构建真核表达载体pIRES2-AQP3/HA-EGF。PCR扩增AQP-3/HA融合基因共需4条引物(表1)：上游引物(U1)，设计XhoI限制性酶切位点(CTCGAG)，含启动子ATG；下游引物(L1)，设计EcoRI限制性酶切位点(GAATTC)，含终止密码子TCA；中间上游引物(UM)和中间下游引物(LM)分别设计HA基因正义链和反义链序列。

表1 重叠PCR引物

质粒构建简要步骤为：①扩增目的片段：以本实验室构建的pEGFP-AQP3-EGFP质粒为模板[12]，在U1/LM和UM/L1引物对指导下利用Pfu高保真酶扩增目的a段和b段，PCR扩增条件为：预变性94 ℃ 5 min，变性94 ℃ 30 s，退火64 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 3 min，循环30次；72℃ 10 min，4 ℃保存。而后，以纯化的a段和b段为模板，利用U1/L1引物对和KODDNApolymerase高保真酶扩增AQP-3/HA片段后并纯化，PCR扩增分两步：反应体系无引物，预变性94 ℃ 5 min，变性94 ℃ 30 s，退火64 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 90 s，循环5次；反应体系加入U1/L1引物对后，预变性94 ℃ 5 min，变性94 ℃ 30 s，退火64 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 3 min，循环30次；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。②质粒构建：在37 °C下，XhoI和EcoRI双酶切pIRES2-EGFP质粒和AQP-3/HA片段12 h，纯化酶切产物；在16 °C下，Ligation high连接酶连接经双酶切的质粒和目的片段30 min；连接产物转化感受态的大肠杆菌TOP10菌株后，将适当体积的菌液均匀涂抹至LB琼脂板(含30 mg/L卡那霉素)；菌液吸收后，将琼脂板倒置于37 °C培养箱内，12～16 h后可出现菌落。③克隆鉴定：挑取单克隆菌落并摇菌，PCR初步鉴定是否构建成功；选择阳性组菌液提取质粒，送公司测序鉴定。

1.2.3 免疫荧光及胶体金标记 脂质体LipofectamineTM2000介导真核表达载体pIRES2-AQP-3/HA-EGFP转染CNE-1细胞，常规胰酶消化的细胞悬液，种植于24孔细胞培养板中(内贴6 mm无菌盖玻片)过夜培养。PBS洗涤细胞3次后，滴加40 mL/L低聚甲醛溶液500 μL固定15 min；PBS洗涤细胞6次后，5 mL/L Triton X-100孵育细胞5 min，再用PBS洗涤细胞6次；100 mL/L血清室温封闭细胞45 min后，10 mL/L血清洗涤细胞1次；于4 °C条件下，10 mL/L血清稀释的HA一抗过夜孵育细胞后，用10 mL/L血清洗涤细胞6次；于室温条件下，10 mL/L血清稀释的二抗孵育1 h后，用PBS洗涤细胞6次；500 g/L甘油碳酸盐缓冲液封片，指甲油封边；最后，在Nikon C1-si激光共聚焦显微镜下观察荧光标记并拍照。

真核表达载体转染CNE-1细胞24 h后，470 g/L低渗溶液处理细胞15 min；用470 mL/L低渗甲醛固定液固定细胞15 min后，参照上述步骤HA抗体标记细胞后，再用10 nm胶体金标记的二抗识别HA抗体，三蒸水洗涤细胞3次，于空气中自然晾干。在倒置荧光显微镜下，选择表达绿色荧光蛋白的CNE-1细胞，曲率半径10 nm、共振频率150 kHz以及弹性系数5 N/m的AFM探针扫描细胞表面(Bioscope Catalyst NanoScope-VAFM，Veeco instruments，美国)，观察细胞膜胶体金颗粒，从而分析AQP-3蛋白分布情况。

2 结果

2.1 AQP-3/HA突变真核表达载体

标签蛋白与目的蛋白融合表达后，便于目的蛋白的表达、检测、纯化和示踪等。HA标签蛋白仅含9个氨基酸(YPYDVPDYA)，对外源靶蛋白的空间结构影响小，构建AQP-3/HA融合表达载体，利用HA抗体示踪细胞膜AQP-3蛋白。AQP-3第一个胞外段较短且第三个胞外段附近包含天冬酰胺-脯氨酸-丙氨酸(Asn-Pro-Ala，NPA)保守序列，将HA标签蛋白插入第二个胞外段中可能会减小外源氨基酸片段对AQP-3水通道功能的影响，即T149-Y150之间。利用Pfu高保真酶扩增目的a段和b段；以纯化的a段和b段为模板，利用KODDNApolymerase高保真酶扩增AQP-3/HA片段；将AQP-3/HA双酶切产物插入到pIRES2-EGFP中，转化大肠杆菌后培养菌落，挑取单克隆菌落测序鉴定，将构建成功的质粒命名为：pIRES2-AQP3/HA-EGFP(图1)。

2.2 免疫荧光标记AQP-3/HA融合蛋白

质粒pIRES2-AQP3/HA-EGFP转染CNE-1细胞24 h 后，倒置荧光显微镜下可观察到部分CNE-1细胞发出绿色荧光，提示质粒成功转染细胞并表达绿色荧光蛋白。利用免疫荧光标记目的蛋白，激光共聚焦显微镜下拍照观察：绿色荧光蛋白指示转染成功的CNE-1细胞；Alexa Fluor 405标记HA抗体呈蓝色，识别AQP-3/HA融合蛋白，AQP-3/HA主要分布在细胞膜上(图2)。

2.3 AFM观察AQP-3/HA融合蛋白分布

采用胶体金标记抗体识别AQP-3/HA融合水通道，借助AFM观察胶体金颗粒从而分析AQP-3蛋白分布情况。

AFM扫描成功转染pIRES2-AQP3/HA-EGFP质粒的CNE-1细胞，由免疫荧光结果可知，该细胞表达AQP-3/HA融合蛋白；使用AFM扫描细胞，得到了分辨率远高于光镜的CNE-1细胞表面图像，细胞表面凹凸不平并伸出形状各异的片状伪足以及长短不同的丝状伪足。选取3个不同区域(4 μm×4 μm)进行高分辨率扫描，对其中1 μm×1 μm区域进行观察，细胞膜表面分布有均一的圆形颗粒，代表HA抗体上标记的10 nm胶体金颗粒；部分圆形颗粒所在位置有微小空洞存在，可能为AQP-3/HA融合水通道蛋白；图3B～C所示区域的圆形颗粒以及微小空洞比图3A所示区域多，提示AQP-3在细胞膜表面分布有差异性，即在突起部位分布较多。

3 讨论

荧光标记、同位素标记等是示踪生物大分子最常见的技术手段[13-14]。尽管光学成像和核显像技术得到飞速发展，但其对生物大分子的分析，尚不能与电子显微镜的超高分辨率相媲美。AFM借助纳米级扫描探针，可获得纳米级分辨率样品表面形貌结构信息；通过单克隆抗体修饰探针或胶体金标记抗原后，AFM可用于扫描分析生物样本表面抗原物质。本实验采用胶体金标记抗体识别AQP-3/HA水通道融合蛋白后，利用AFM观察胶体金颗粒,从而分析AQP-3蛋白分布情况。

水分子是维系生命的基础，一切生命活动都在水溶液中进行。水分子跨细胞膜转运机制包括经胞膜水通道蛋白(aquaporins，AQPs)和离子通道蛋白转运以及自由扩散等。哺乳动物中鉴定并克隆出13种水通道蛋白(AQP-0～AQP-12)，AQPs为四聚体结构，每个单体包含6个跨膜结构域，氨基末端和羧基末端均位于胞浆侧，上下游的2个NPA保守序列形成水通道的孔道[15]。根据AQPs的渗透特异性，可将水通道分为3类：第一类为经典水通道，仅对水具有通透性，包括AQP-0、AQP-1、AQP-2、AQP-4、AQP-5、AQP-6和AQP-8；第二类为甘油水通道，不仅对水有通透性，也对其他不带电荷的小分子溶质有通透性(尤其是甘油)，包括AQP-3、AQP-7、AQP-9和AQP-10，该类AQPs的第2个NPA序列之后有特征性天冬氨酸残基，被认为是引起水通道孔径增大从而对甘油等小分子物质通透的原因；第三类为超级水通道，包括AQP-11和AQP-12，该类AQPs的NPA序列保守性较差，但其第二个NPA序列之后有高度保守的半胱氨酸残基[16-18]。

依据拓扑结构推测，AQP-3第一个胞外段仅有6个氨基酸且第三个胞外段临近包含NPA保守序列，将HA标签蛋白插入AQP-3第二个胞外段，可能减少标签对水通道功能的影响；利用重叠PCR扩增AQP-3/HA融合基因后，成功构建pIRES2-AQP3/HA-EGFP真核表达载体。AQP-3/HA融合载体转染细胞后，HA抗体可标记到AQP-3/HA融合蛋白，主要分布于细胞膜，对细胞形态无明显影响，提示位于AQP-3第二个胞外段的HA标签蛋白，对其功能影响可能较小。利用AFM获得高分辨率的细胞形貌图，可观察到形状各异的片状伪足以及长短不同的丝状伪足；圆形的胶体金颗粒所在位置有微小空洞存在，提示可能为AQP-3/HA融合水通道蛋白，进一步说明HA标签蛋白对水通道功能影响较小。

综上所述，将HA标签插入AQP-3第二个胞外段，联合胶体金和AFM技术识别HA标签蛋白，能够实现对AQP-3在细胞膜的示踪标记。然而，本实验仅利用AFM识别了AQP-3在固定细胞膜上的分布，未实现对活细胞AQP-3的动态示踪。课题组拟将HA抗体修饰纳米扫描探针后，利用液相AFM动态观察AQP-3在突起形成中的分布特征，探讨其在细胞迁移中的作用机制。