白介素22对星形胶质细胞转化的促进作用及机制研究

甄瑾，春梅，李敏，刘斌，王梅玲，云永利，柳雅洁，马翔凌

白介素（interleukin，IL）-22是由多种免疫细胞分泌的细胞因子，包括辅助性T细胞（helper T cell，Th）17、NK22细胞和Th22［1］，其可参与多种自身免疫性疾病的发生和发展，如系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、多发性硬化（multiple sclerosis，MS）、干燥综合征和银屑病等。MS是典型的中枢神经系统（central nervous system，CNS）特发性炎性脱髓鞘疾病（idiopathic inflammatory demyelinating diseases，IIDDs），其好发于年轻女性。研究证实，IL-22受体α2升高是MS的危险因素［2］，IL-22参与了血-脑脊液屏障（blood brain barrier，BBB）的破坏，进而促进淋巴细胞进入CNS，增加炎症因子释放，加速MS进程［3］。

星形胶质细胞是CNS的一类重要细胞，其可为CNS神经元提供营养支持，促进神经突触形成，且其在维持CNS稳态和功能中起关键作用。研究表明，阿尔茨海默病、帕金森病、MS等神经系统疾病患者以补体C3高表达为特征的A1型星形胶质细胞含量升高［4］；此外，FKBP5、GGTA1、Serping1、Srgn等蛋白表达增加也是A1型星形胶质细胞的重要特征［5］。活化的小胶质细胞可通过分泌IL-1α、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、C1q等细胞因子可诱导星形胶质细胞向A1型星形胶质细胞转化［4］。但IL-22作为MS病理进程中的重要细胞因子，对星形胶质细胞向A1型星形胶质细胞转化是否有影响尚未见报道。本研究旨在探讨IL-22对星形胶质细胞转化的促进作用及可能机制，以期为MS发病机制的研究提供新的方向。

1 材料与方法

1.1 实验时间 本实验时间为2020-06-20至2021-09-23。

1.2 主要试剂和仪器 主要试剂：重组人IL-22蛋白（北京拜尔迪生物技术有限公司，货号：bs-2623R），重组人IL-1α（北京拜尔迪生物技术有限公司，货号：bs-4947p），重组人TNF-α（Abcam公司，货号：ab9642），重组人C1q（Abcam公司，货号：ab96363），TRIzol（美国Sigma公司），反转录试剂盒（Vazyme公司），StarLighter Probe qPCR Mix（Universal）（北京启恒星科技有限公司，FS-Q3002），兔抗C3单抗（Abcam公司，货号：ab200999），兔抗磷酸化-丝裂原活化蛋白激酶p38（phosphorylated p38 mitogen-activated protein kinase，p-p38 MAPK）抗体（北京拜尔迪生物技术有限公司，货号：bs-5476R），兔抗磷酸化-丝裂原活化蛋白激酶活化的蛋白激酶2（phosphorylated mitogen activated protein kinase activated protein kinase 2，p-MAPKAPK-2）抗体（北京拜尔迪生物技术有限公司，货号：bs-5503R），二抗羊抗兔单克隆抗体（上海碧云天生物技术有限公司，货号：A0208）。主要仪器：细胞二氧化碳培养箱（SANYO，MCO-175），Vortex振荡器（Kylin-Bell Lab Instruments，XW-80A），移液器（Eppendorf Reference，4924000908），混匀仪（其林贝尔仪器制造有限公司，TS-100），Nanodrop分光光度计（Thermo，2000/2000C），qPCR仪（ABI，VII7），SDS-Acryl/Bis蛋白电泳仪（上海天能科技有限公司，VE-180），蛋白转膜仪（上海天能科技有限公司，VE-186），化学发光成像系统（GE，AI600）。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养 将人星形胶质细胞HA1800（购自中国科学院上海细胞库）在AM1801培养基中培养（传代不超过10代），待细胞生长融合至90%，采用0.25%胰酶消化细胞并加入4 ml完全培养基，轻轻吹打细胞，转入15 ml离心管中，800 r/min（离心半径10 cm）离心3 min，弃上清液。再用3 ml含10% FBS的完全培养基重悬细胞，并将其分到3个T25细胞培养瓶中，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。

1.3.2 qPCR 将人星形胶质细胞分为对照组、IL-22处理组、C1q+TNF-α+IL-1α处理组及C1q+TNF-α+IL-1α+IL-22处理组。对照组细胞未进行特殊处理，IL-22处理组细胞给予IL-22（400 ng/ml）处理48 h，C1q+TNF-α+IL-1α处理组细胞给予C1q（400 ng/ml）、TNF-α（30 ng/ml）、IL-1α（3 ng/ml）联合处理48 h，C1q+TNF-α+IL-1α+IL-22处理组细胞给予C1q（400 ng/ml）、TNF-α（30 ng/ml）、IL-1α（3 ng/ml）、IL-22（400 ng/ml）联合处理48 h。之后采用胰蛋白酶消化并收集细胞。采用Trizol法提取细胞总RNA，Nanodrop 100分光光度计检测RNA浓度及质量。将1.0 μg RNA进行反转录，得到cDNA的第一链，之后以cDNA为模板进行qPCR，检测补体C3 mRNA表达水平，实验独立重复3次。

将人星形胶质细胞分为对照组和IL-22处理组，对照组细胞未进行特殊处理；IL-22处理组细胞给予IL-22（400 ng/ml）处理48 h。采用qPCR检测FKBP5、GGTA1、Serping1、Srgn mRNA表达水平，检测步骤同上，实验独立重复3次。qPCR引物序列见表1。

表1 qPCR引物序列Table 1 qPCR primer sequences

1.3.3 Western blot法 将人星形胶质细胞分为对照组、IL-22处理组、C1q+TNF-α+IL-1α处理组及C1q+TNF-α+IL-1α+IL-22处理组。对照组细胞未进行特殊处理，IL-22处理组细胞给予IL-22（400 ng/ml）处理48 h，C1q+TNF-α+IL-1α处理组细胞给予C1q（400 ng/ml）、TNF-α（30 ng/ml）、IL-1α（3 ng/ml）联合处理48 h，C1q+TNF-α+IL-1α+IL-22处理组细胞给予C1q（400 ng/ml）、TNF-α（30 ng/ml）、IL-1α（3 ng/ml）、IL-22（400 ng/ml）联合处理48 h。之后采用胰蛋白酶消化并收集细胞，加入200 μl细胞裂解液（150 mmol/L NaCl，1% NP-40，0.1% SDS，1 mmol/L PMSF，1%蛋白酶抑制剂），置于冰上裂解10 min。4 ℃环境下，12 000 r/min（离心半径10 cm）离心10 min。将上清液转移到新的EP管中，加上样缓冲液；4 ℃环境下，12 000 r/min（离心半径10 cm）离心1 min，采用Bradford法检测总蛋白浓度。然后取20 μg总蛋白进行SDS-PAGE，电泳完成后将蛋白转移到PVDF膜上，采用5%脱脂牛奶室温摇床封闭1 h，TBST洗膜3次，5 min/次。加入一抗（1∶2 000），4 ℃过夜；加入二抗（1∶3 000）室温孵育1 h。TBST洗膜3次，10 min/次。采用ECL法显色，检测补体C3蛋白表达水平，实验独立重复3次。

将人星形胶质细胞分为对照组、IL-22处理组、丝裂原活化蛋白激酶p38（p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK）抑制剂处理组、IL-22+p38 MAPK抑制剂处理组。对照组细胞未进行处理，IL-22处理组细胞采用IL-22（400 ng/ml）处理60 min，p38 MAPK抑制剂处理组细胞采用p38 MAPK 抑制剂SB202190（10 μmol/L）处理60 min，IL-22+p38 MAPK抑制剂处理组细胞采用IL-22（400 ng/ml）、p38 MAPK 抑制剂SB202190（10 μmol/L）处理60 min。采用Western blot法检测磷酸化p38（phosphorylated p38，p-p38）、p-MAPKAPK-2、补体C3蛋白表达水平，检测方法同上，实验独立重复3次。

1.4 统计学方法 采用Graphpad prism 9.0软件进行统计学处理。符合正态分布的计量资料以（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用q检验，两组间比较采用成组t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 IL-22促进星形胶质细胞补体C3 mRNA、蛋白表达 对照组、IL-22处理组、C1q+TNF-α+IL-1α处理组、C1q+TNF-α+IL-1α+IL-22处理组补体C3 mRNA、蛋白表达水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；IL-22处理组、C1q+TNF-α+IL-1α处理组及C1q+TNF-α+IL-1α+IL-22处理组补体C3 mRNA、蛋白表达水平高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；C1q+TNF-α+IL-1α处理组、C1q+TNF-α+IL-1α+IL-22处理组补体C3 mRNA、蛋白表达水平高于IL-22处理组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2、图1。

表2 对照组、IL-22处理组、C1q+TNF-α+IL-1α处理组及C1q+TNF-α+IL-1α+IL-22处理组补体C3 mRNA、蛋白表达水平比较（±s，n=3）Table 2 Comparison of expression levels of complement C3 mRNA and protein in the control group，IL-22 interventional group，C1q+TNF-α+IL-1α interventional group and C1q+TNF-α+IL-1α+IL-22 interventional group

表2 对照组、IL-22处理组、C1q+TNF-α+IL-1α处理组及C1q+TNF-α+IL-1α+IL-22处理组补体C3 mRNA、蛋白表达水平比较（±s，n=3）Table 2 Comparison of expression levels of complement C3 mRNA and protein in the control group，IL-22 interventional group，C1q+TNF-α+IL-1α interventional group and C1q+TNF-α+IL-1α+IL-22 interventional group

注：IL=白介素，TNF-α=肿瘤坏死因子α；a表示与对照组比较，P＜0.05；b表示与IL-22处理组比较，P＜0.05

组别 补体C3 mRNA 补体C3蛋白对照组 1.001±0.063 0.361±0.023 IL-22处理组 1.848±0.054a 0.618±0.029a C1q+TNF-α+IL-1α处理组 2.622±0.084ab 0.720±0.064ab C1q+TNF-α+IL-1α+IL-22处理组 2.760±0.096ab 1.195±0.075ab F值 340.700 132.787 P值 ＜0.001 ＜0.001

图1 对照组、IL-22处理组、C1q+TNF-α+IL-1α处理组、C1q+TNF-α+IL-1α+IL-22处理组补体C3蛋白SDS-PAGE图Figure 1 SDS-PAGE of complement C3 protein in the control group，IL-22 interventional group，C1q+TNF-α+IL-1α interventional group and C1q+TNF-α+IL-1α+IL-22 interventional group

2.2 IL-22促进星形胶质细胞FKBP5、GGTA1、Serping1、Srgn mRNA表达 IL-22处理组FKBP5、GGTA1、Serping1、Srgn mRNA表达水平高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表3。

表3 对照组和IL-22处理组FKBP5、GGTA1、Serping1、Srgn mRNA表达水平比较（±s，n=3）Table 3 Comparison of mRNA expression levels of FKBP5，GGTA1，Serping1 and Srgn between control group and IL-22 interventional group

表3 对照组和IL-22处理组FKBP5、GGTA1、Serping1、Srgn mRNA表达水平比较（±s，n=3）Table 3 Comparison of mRNA expression levels of FKBP5，GGTA1，Serping1 and Srgn between control group and IL-22 interventional group

组别 FKBP5 GGTA1 Serping1 Srgn对照组 1.003±0.087 0.813±0.150 1.432±0.076 1.585±0.392 IL-22处理组 1.262±0.084 1.566±0.115 2.503±0.368 2.655±0.116 t值 -3.709 -6.900 -4.937 -4.533 P值 0.021 0.002 0.008 0.011

2.3 IL-22调控星形胶质细胞补体C3蛋白表达的相关信号通路 对照组、IL-22处理组、p38 MAPK抑制剂处理组、IL-22+p38 MAPK抑制剂处理组p-p38、p-MAPKAPK-2、补体C3蛋白表达水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；IL-22处理组p-p38、p-MAPKAPK-2、补体C3蛋白表达水平高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；p38 MAPK抑制剂处理组p-p38、p-MAPKAPK-2、补体C3蛋白表达水平低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；IL-22+p38 MAPK抑制剂处理组p-p38、p-MAPKAPK-2、补体C3蛋白表达水平低于IL-22处理组，但高于p38 MAPK抑制剂处理组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表4、图2。

图2 对照组、IL-22处理组、p38 MAPK抑制剂处理组、IL-22+p38 MAPK抑制剂处理组p-p38、p-MAPKAPK-2、补体C3蛋白SDS-PAGE电泳图Figure 2 SDS-PAGE electrophoresis of p-p38，p-MAPKAPK-2 and complement C3 protein in control group，IL-22 interventional group，p38 MAPK inhibitor interventional group and IL-22+p38 MAPK inhibitor interventional group

表4 对照组、IL-22处理组、p38 MAPK抑制剂处理组、IL-22+p38 MAPK抑制剂处理组p-p38、p-MAPKAPK-2、补体C3蛋白表达水平比较（±s，n=3）Table 4 Comparison of expression levels of p-p38，p-MAPKAPK-2 and complement C3 protein in control group，IL-22 interventional group，p38 MAPK inhibitor interventional group and IL-22+p38 MAPK inhibitor interventional group

表4 对照组、IL-22处理组、p38 MAPK抑制剂处理组、IL-22+p38 MAPK抑制剂处理组p-p38、p-MAPKAPK-2、补体C3蛋白表达水平比较（±s，n=3）Table 4 Comparison of expression levels of p-p38，p-MAPKAPK-2 and complement C3 protein in control group，IL-22 interventional group，p38 MAPK inhibitor interventional group and IL-22+p38 MAPK inhibitor interventional group

注：p38 MAPK=丝裂原活化蛋白激酶p38，p-p38=磷酸化p38，p-MAPKAPK-2=磷酸化-丝裂原活化蛋白激酶活化的蛋白激酶2；a表示与对照组比较，P＜0.05；b表示与IL-22处理组比较，P＜0.05；c表示与p38 MAPK抑制剂处理组比较，P＜0.05

组别 p-p38 p-MAPKAPK-2 补体C3蛋白对照组 0.761±0.067 0.827±0.018 0.956±0.050 IL-22处理组 1.218±0.043a 1.244±0.052a 1.145±0.068a p38 MAPK抑制剂处理组 0.631±0.013a 0.682±0.011a 0.574±0.015a IL-22+p38 MAPK抑制剂处理组 0.755±0.060bc 0.872±0.041bc 0.912±0.100bc F值 78.854 139.748 39.197 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

3 讨论

IL-22是IL-10家族成员，人IL-22由146个氨基酸组成，其与小鼠IL-22有80.8%的同源性，是一个具有α螺旋的二级结构，其通过与IL-22受体结合可发挥生物学活性［6］。IL-22受体属于Ⅱ级细胞因子受体家族，由两个亚单位组成，即IL-22受体1和IL-10受体2，前者主要表达于非免疫组织，如皮肤、肺脏、肾脏、胰腺等；后者广泛表达于免疫细胞，如T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞等。研究表明，在小鼠和人肾脏细胞中，IL-22受体被激活后可引起STAT3和STAT5磷酸化，而IL-22可以活化JAK1和TYK2，从而激活丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路［7-8］。

CNS受损时，星形胶质细胞会转化成反应性星形胶质细胞，但反应性星形胶质细胞对CNS的修复作用尚存在争议［9-10］。有研究者通过纯化和遗传分析反应性星形胶质细胞发现，星形胶质细胞可以被激活成两种极化状态：A1型（神经毒性或促炎表型）和A2型（神经保护或抗炎表型）［11］，尽管上述分型并不能完全代表反应性星形胶质细胞表型，但其有助于理解不同CNS疾病中星形胶质细胞的反应状态。

星形胶质细胞是最丰富的胶质细胞，对CNS功能维持具有重要作用，其可以参与神经发育过程中神经元的突触形成、成熟和消除［12］。当CNS损伤时，星形胶质细胞在细胞外环境中可改变自身形态和功能特征，从而转化为反应性星形胶质细胞［13］。与正常星形胶质细胞相比，A1型星形胶质细胞具有以下特征：突触功能下降，吞噬能力降低，神经毒性增强［14］。一般情况下，神经胶质细胞能维持CNS中的神经元存活，但A1型星形胶质细胞可以分泌可溶性毒素，进而迅速杀伤神经元和成熟的少突胶质细胞［15］。而CNS中小胶质细胞分泌的多种炎性因子可共同活化星形胶质细胞，进而在多种CNS疾病中发挥生物学作用［16］。

研究表明，MS的发病机制复杂，涉及多种细胞和信号通路，除小胶质细胞、巨噬细胞等外，星形胶质细胞也在其中发挥了重要作用［15］。局灶性白质活动性病变患者星形胶质细胞肥大，可表达高水平的胶质纤维酸性蛋白，促进炎性细胞因子、趋化因子表达及髓鞘再生，进而参与MS的发生［17］；同时，在特定条件下星形胶质细胞还表现出抗原递呈细胞的特征，促进免疫细胞应答，加速CNS中的免疫损伤；再者，星形胶质细胞还与MS的硬化斑块形成直接相关［18］。因此，研究星形胶质细胞的转化机制可能对MS的治疗具有一定帮助。

研究表明，细胞因子IL-1α、TNF-α和C1q可以诱导星形胶质细胞向A1型星形胶质细胞转化［12］。本研究结果显示，IL-22处理组补体C3 mRNA、蛋白表达水平及FKBP5、GGTA1、Serping1、Srgn mRNA表达水平均高于对照组，提示IL-22可以促进星形胶质细胞转化为A1型星形胶质细胞；C1q+TNF-α+IL-1α处理组、C1q+TNF-α+IL-1α+IL-22处理组补体C3 mRNA、蛋白表达水平高于IL-22处理组，提示C1q、TNF-α、IL-1α对星形胶质细胞转化的促进作用强于IL-22，但其相互之间的作用复杂，其机制有待于进一步阐明。

IL-22作为一种重要的细胞因子，可以激活多种信号通路［19］。本研究结果显示，IL-22处理组p-p38、p-MAPKAPK-2、补体C3蛋白表达水平高于对照组；p38 MAPK抑制剂处理组p-p38、p-MAPKAPK-2、补体C3蛋白表达水平低于对照组；IL-22+p38 MAPK抑制剂处理组p-p38、p-MAPKAPK-2、补体C3蛋白表达水平低于IL-22处理组，但高于p38 MAPK抑制剂处理组；提示IL-22可能通过促进丝裂原活化蛋白激酶活化的蛋白激酶2（mitogen activated protein kinase activated protein kinase 2，MAPKAPK-2）磷酸化而激活p38-MAPK信号通路，进而促进补体C3蛋白表达。

综上所述，IL-22可促进星形胶质细胞向A1型星形胶质细胞转化，其机制可能与IL-22促进MAPKAPK-2磷酸化，进而激活p38-MAPK信号通路有关，这为MS发病机制的研究提供了新方向。

作者贡献：甄瑾、马翔凌进行文章的构思与设计；春梅、李敏、刘斌进行研究的实施与可行性分析；王梅玲、柳雅洁进行数据收集、整理、分析；春梅、云永利进行结果分析与解释；甄瑾撰写、修订论文，负责质量控制及审校，并对文章整体负责、监督管理。

本文无利益冲突。