小麦抗白粉病基因Pm2的研究进展*

靳玉丽,谷田田,柳 洪,安调过

(中国科学院遗传与发育生物学研究所农业资源研究中心 石家庄 050022)

小麦(L.)是世界上最重要的粮食作物之一,养活了超过1/3 的人口。作为世界上最大的小麦生产国和消费国,小麦的高产、稳产对保障我国粮食安全和农业可持续发展具有重大现实和战略意义。由布氏白粉病菌(f.sp.,)引起的白粉病是影响小麦产量最严重的病害之一,小麦病虫害造成的产量损失中5%是由小麦白粉病造成的。近十年,我国小麦白粉病发病面积每年在667 万hm以上,造成年均损失产量约1000 万t,严重威胁我国小麦的安全生产(https://www.natesc.org.cn)。

1930年,澳大利亚科学家Waterhouse 首次报道了来自小麦品种‘Thew’的显性抗白粉病基因。截至目前,已鉴定出68 个正式命名的小麦抗白粉病基因,分布于63 个位点(,和是等位基因,=,=,=,=),主要来自小麦的农家品种、育成品种、近缘属种以及小麦的祖先种。随着测序技术的不断发展及参考基因组的不断完善,目前已有13个小麦抗白粉病基因相继被克隆,包括、、、、、、、、、、、和。其中,和为成株抗性基因,其余均表现为全生育期小种专化抗性。、、、、及在我国已部分或完全丧失抗性;来源于簇毛麦(),主要分布在西南和长江中下游麦区的育成品种中,在黄淮小麦主产区大面积推广的品种中较少;来源于农家品种‘齿牙糙’,来源于野生二粒小麦(var.),来源于小麦A 基因组供体乌拉尔图小麦(),这些来源于农家品种和小麦近缘属种的抗病基因多与不利性状连锁,无法直接作为小麦抗病育种亲本使用,需要与小麦主栽品种进行多代回交、自交,打破连锁累赘后才能应用于小麦育种;广泛分布于我国乃至世界小麦种植区,在育成品种、农家品种、国外引进品种和高代品系中均有发现,其抗性表现优异,农艺性状良好,被广泛应用于小麦抗白粉病育种。因此,本文将从以下几个方面总结相关的最新研究进展,以期为抗病机制的进一步解析及其在生产上的应用提供理论依据。

1 Pm2 定位的研究进展

1.1 小麦抗白粉病基因Pm2 位点的发现

1953年,澳大利亚阿德莱德大学Pugsley 和澳大利亚联邦科工组织Carter 利用两个白粉菌菌株P 和P-1 对12 个小麦品种进行抗性鉴定,根据其反应型差异,将这12 个小麦品种分成了3 个类群。在此基础上,通过对不同类群的品种间杂交后代进行遗传分析,明确了其中8 个品种‘Axminster’ ‘Thew’‘Kenya C6041’ ‘Bridproof’ ‘Converse’ ‘Norka’ ‘Normandie’和‘Huron’为第一类群,它们均含有相同的抗白粉病基因,后被正式命名为; 来自美国北达科塔州的小麦品种‘Ulka’(当地农民从俄罗斯引进的农家品种)为第2 类群,其携带的抗白粉病基因为,后被正式命名为; 第3 类群包括品种‘Sonora’ ‘Indian’和‘Sturgeon’,含有相同的抗白粉病基因,后被正式命名为。1970年,澳大利亚悉尼大学McIntosh 和Baker 利用单体系分析将‘Ulka’中的基因定位于小麦5DS 染色体上近着丝粒的位置。

1.2 Pm2 的分子标记定位

随着分子标记技术的不断发展,越来越多的标记被应用于的定位。1994年,Ma 等利用感白粉病的‘Chancellor’与‘Ulka/8*Cc’(CI14118)杂交构建的F分离群体进行分子标记定位,发现与5DS 上的RFLP 标记连锁,遗传距离为3.5 cM。随后,Qiu 等利用‘中国春’与‘CI14118’杂交构建的包含814 个F单株的分离群体,通过集群分离分析法(bulk segregant analysis,BSA)筛选获得了3 个与连锁的SSR 标记、和,与的遗传距离分别为2.0 cM、34.2 cM和44.2 cM。

2 Pm2 等位基因的发掘

从发现至今,已从育成品种、农家品种、引进品种、小麦品系等各类小麦材料中发掘出多个的等位基因。赵军发现北美硬红春小麦品种‘Grandin’携带基因,距两侧分子标记和的遗传距离分别为0.9 cM 和3.3 cM。引自英国的小麦品种‘Brock’对我国小麦白粉病菌多年表现良好的抗性,李根桥等将其抗白粉病基因定位于分子标记和之间,标记和与抗病基因共分离,推断该抗白粉病基因为。随后,中国农业科学院作物科学研究所李洪杰实验室将小麦品种‘良星66’ ‘汶农14’和‘中麦155’携带的抗白粉病基因、和均定位于5DS 染色体上,与分子标记和紧密连锁。Sun 等通过等位性测试明确了和与位于同一位点,并根据它们与基因对60 个不同白粉病菌株的抗性差异,推断和可能是位点的新等位基因。李丹等将小麦品种‘农大399’中的抗白粉病基因定位于小麦染色体5DS Bin 0.67～0.78 区间,根据其定位区间,推测是。小麦品系DH155 对白粉病菌表现高抗,管昌英等将其携带的抗白粉病基因定位于标记和之间,遗传距离分别为0.2 cM 和0.8 cM,抗谱分析结果表明可能是或其等位基因。

本实验室利用采集于不同地区的小麦白粉病菌株对5000 余份包括小麦育成品种、高代品系、农家品种、国外引进品种、近缘种和人工合成麦等不同类型的小麦种质资源进行了系统的抗病性鉴定,通过遗传分析、分子标记定位等手段从中发掘出了一系列的新等位基因,这些携带等位基因的材料对不同毒力的白粉病菌株均具有特异的抗谱,且大部分具有广谱抗性。同时,结合不同地区来源的白粉病菌株的抗谱分析和农艺性状评价,对这些携带等位基因的材料进行了系统的育种价值分析,筛选出了一批具有重要育种价值的广谱抗病材料。其中,KM2939 是一个多花多粒的小麦-冰草[(L.) Gaertn]育种新品系,对小麦白粉病具有广谱抗性,苗期对供试的50 个白粉病菌株中的48 个表现抗性,遗传分析表明其抗性由单个显性抗白粉病基因控制。利用分子标记将该基因定位于小麦5DS 染色体上,与两侧标记和的遗传距离分别为0.5 cM 和1.3 cM。抗谱分析和等位性测试结果表明,为位点的一个新等位基因,由国际小麦基因命名委员会正式定名为。与此同时,在我国小麦农家品种‘鸟麦’中也鉴定到一个定位于5DS 染色体相同区段的抗白粉病基因,抗谱分析和等位性测试结果表明是位点的另一等位基因,正式定名为。此外,在小麦育成品种‘婴泊700’、育成品系万丰鉴34、10V-2、X3986-2,国外引进新品系FG-1 和Subtil 中均鉴定到定位于5DS 上的抗白粉病基因,抗谱分析和等位性测试结果表明,它们均是位点新的等位基因。本实验室发掘的这些携带等位基因的材料对不同毒性的白粉病菌株具有特异抗谱,且差异明显,极大地丰富了基因的遗传多样性。

3 Pm2 克隆的研究进展

被广泛应用于小麦抗白粉病育种,克隆对明确该位点遗传和基因组特征、解析其抗病机制具有重要的意义。Sáchez-Martín 等通过Mut-ChromSeq(Mutant chromosome sequencing)的策略快速克隆了小麦抗白粉病基因。他们首先利用甲基磺酸乙酯(ethylmethylsulfone,EMS)处理基因的载体品种‘Ulka’,获得了12 个感病突变体。在此基础上,对其中的6 个突变体进行染色体分拣、测序和组装,找到了2 个长度大于1 kb 且含有NBSLRR(NLR)序列的候选Contig。其中一个与野生型‘Ulka’相比,存在大量的单核苷酸变异(Single Nucleotide Variation,SNV),可能是错误的组装所致; 另一个10 kb 的contig 含有一个全长的NLR 基因,并通过PCR 扩增和测序进行了验证。随后,利用基于该基因序列开发的PCR 标记在80 个感病F单株中扩增发现,该标记与共分离。对其他6 个感病突变体中该NLR 基因进行扩增测序的结果也证实了这个contig 中含有的基因是。

Chen 等通过对小麦品系CH1357 的抗白粉病基因进行精细定位,发现与基因具有等位关系,利用2252 个Taichung29/CH1357 的F家系并结合90K Illumina SNP 芯片测序技术将定位于标记和之间,对应‘中国春’参考基因组(Ref V1.0)5DS 染色体上525.64 kb 的物理区间,该目标区间仅包含1 个基因,编码典型的CCNBS-LRR 蛋白。同时,本实验室利用的载体材料KM2939 与感病品种杂交构建遗传分离群体并结合混池转录组测序技术(BSA-RNA sequencing,BSR-seq)分析克隆了。序列分析发现,与及具有完全一致的基因序列,为同一个基因。

4 Pm2 功能标记的开发及单倍型分析

4.1 功能标记的开发及应用

通过分析在抗病材料‘Ulka’、CH1357 和KM2939 与感病材料‘中国春’和Taichung29 中的序列变异,发现感病材料中的等位基因第一个外显子上含有一个7 bp 的序列缺失,导致所编码的蛋白出现了提前终止,缺失了大部分的NBS 和全部的LRR 结构域。根据该7 bp 缺失,开发了功能标记TaPm2、JS322/JS362和Pm2b-map-3,它们均可用于基因的分子标记检测。Chen 等利用的功能标记TaPm2 检测了261 份中国小麦微核心种质,164 份小麦育成品种以及70 份美国小麦品种,发现分别有3 份、6 份和1 份材料携带抗白粉病基因。 Manser 等利用的功能标记JS322/JS362 检测了487 份普通小麦和150 份粗山羊草()材料,在48 份普通小麦材料和28 份粗山羊草材料中检测到了。Jin 等利用的功能标记Pm2b-map-3 检测了659 份小麦材料,发现393 份均携带。功能标记的开发促进了在分子标记辅助选择抗病育种中的应用。

4.2 单倍型分析

研究发现位点存在多个等位基因。Chen等根据已克隆的基因序列,设计引物并扩增了抗谱存在显著差异的等位基因、和,发现它们具有与一致的序列。Manser 等对76 份携带的材料进行序列分析,发现来源于六倍体小麦的48 份材料的基因序列与完全一致,因此推测在六倍体小麦基因池中仅存在一种抗病单倍型; 在28 份粗山羊草中发现了7 个新的等位变异,即-,其中,、、、和相似性较高,仅分别存在2、6、3 和4 个氨基酸的变异,、、与相比差异较大,且氨基酸变异主要发生在LRR 结构域。

5 Pm2 无毒基因的克隆及单倍型分析

禾谷类白粉菌与其寄主之间的互作符合“基因对基因”假说。在寄主中存在编码免疫受体的基因,它们大多属于保守的NLR 蛋白家族,具有识别和启动下游防卫反应的功能。而在病原菌中存在有与基因相对应的无毒基因,它们的编码产物能直接或间接与R 蛋白互作,激活寄主抗病反应,达到防御病害的目的。

5.1 AvrPm2 的克隆

Praz 等通过遗传作图和关联分析相结合的手段克隆了对应的无毒基因。将白粉病菌株96224(无毒)和JIW2(有毒)杂交,构建了遗传分离群体,利用的近等基因系Ulka/8*Chancellor、Federation*4/Ulka 和CI12632/8*Chancellor 群体进行表型鉴定; 同时利用12 个有毒和30 个无毒的小麦白粉病菌株及18 个小黑麦()白粉病菌株的测序数据进行全基因组关联分析,克隆了无毒基因,并利用烟草瞬时表达系统证明了能够与特异识别并引起寄主的过敏性坏死反应,从而确认了为与对应的无毒基因。

5.2 AvrPm2 的功能解析

Praz 等在的无毒菌株96224 基因组中,发现非缺失区的转座子类型主要是高拷贝的Copia 转座子,并提出了一种模型解释基因缺失可能的分子机制,即缺失区域两侧的Copia转座子通过同源重组的方式发生交换,导致含有soloLTR 的中间区域缺失。这些结果说明小麦白粉菌效应因子的进化与转座子相关,且这种机制在禾谷类白粉菌中普遍存在。属于典型的分泌性效应蛋白,其编码蛋白N 端为含有21 个氨基酸的信号肽,信号肽下游为保守的Y(x)xC 基序。在结构上还与已知的RNase 类核糖核酸酶具有同源性,这类酶对吸器的形成是必需的。因此,推测可能具有双重功能: 一是在非亲和互作中具有与识别并激发寄主免疫反应的功能; 二是在亲和性互作中参与吸器的形成,抑制寄主细胞防卫反应的功能。但与的互作机制尚需要进一步的生理生化证据来解析。

5.3 AvrPm2 的单倍型分析

Manser 等在白粉病菌株USA7 和USA2 中发现了的另两个单倍型和。序列分析发现,与相比,仅在第67 位氨基酸上发生了变异,由甘氨酸变成了丝氨酸;的第67 位氨基酸由甘氨酸变成了丝氨酸,第96 位的缬氨酸变成了天冬氨酸。利用白粉病菌株USA7 和USA2 对的近等基因系进行离体鉴定,发现USA7 携带的H1 是的无毒基因,而USA2 携带的H2 对是有毒的。因此,只有可以被特异性识别。

6 Pm2 在小麦抗白粉病育种中的应用

在我国小麦抗病育种中发挥了重要的作用。山东省农业科学院作物科学研究所系统选育的高产、多抗小麦新品种‘济麦22’,在山东省和黄淮北片审定和大面积推广,截至2020年夏收,累计推广面积2000 万hm(http://www.saas.ac.cn/art/2021/1/11/art_1847991028 4451.html)。以‘济91102’和‘济935031’为亲本选育而成的国审小麦品种‘良星66’,在黄淮冬麦区北片的山东、河北中南部、山西南部、河南安阳等地推广种植。利用英国高产抗病小麦品种‘Riband’与河南小麦品种‘温麦6 号’和‘周麦13’杂交和回交,育成的高产抗病小麦新品种‘农大1108’,在河南省和陕西省审定并推广种植。利用意大利品种‘Torino’与‘冀麦38’和‘石4185’等进行杂交和回交,育成的高产抗病节水的小麦新品种‘农大399’,在河北省中南部审定并推广种植。利用‘豫麦34’为母本、‘济麦22’为父本杂交后回交并利用分子标记辅助选育而成的‘济麦23’,在山东省审定并推广种植。遗传分析和分子标记结果表明这些主栽品种均携带小麦抗白粉病基因。

胡娜等利用的连锁标记检测了260 份小麦材料,包括35 份国外引进品种,1 份农家品种及224 份高代品系及育成品种,发现有145 份材料携带,占供试材料的55.8%。曹廷杰等利用与紧密连锁的分子标记检测了908 份河南省参加区试和预试的小麦材料,发现其中8 个材料携带,分别是‘遂民081’ ‘农大1108’ ‘郑麦117’‘中麦61’ ‘德麦1201’ ‘郑麦129’ ‘偃展03114’和‘天宝2018’。刘理森等利用与紧密连锁的分子标记检测了241 份小麦品种(系),发现有13份材料携带,包括‘郑麦129’ ‘邯09-41344’‘邯农2312’ ‘LS4223’ ‘南大2419’ ‘苏麦3 号’ ‘火麦’‘宁春4 号’ ‘兴义4 号’ ‘汉中白’ ‘扁头光秃麦’ ‘长芒石扁头’和‘红春麦’。刘易科等利用的功能标记JS322/JS362 检测了11 份湖北省的小麦主栽品种‘郑麦9023’ ‘鄂麦596’ ‘鄂麦352’ ‘鄂麦580’ ‘鄂麦006’ ‘鄂麦216’ ‘鄂麦325’ ‘襄麦25’ ‘襄麦55’ ‘襄麦35’和‘襄麦D31’,发现它们均携带。本实验室利用的功能标记Pm2b-map-3 检测了411 份高代品系、165 份育成品种、42 份引进品种、37 份异染色体系和4 份农家品种共659 份小麦材料,发现有252 份高代品系、83 份育成品种、33 份引进品种、5 份异染色体系和3 份农家品种共393 份材料携带,占供试材料的59.6%。

的载体材料‘KM2939’是一个多花多粒、综合农艺性状优良的小麦育种新品系,苗期和成株期均高抗白粉病。本实验室将KM2939 与黄淮麦区高感白粉病的主栽品种杂交,创建了3 个以主栽品种‘石麦15’ ‘石新828’和‘科农199’为背景的近等基因系,其背景恢复率分别达99.0%、98.9%和99.0%;进一步结合的分子标记辅助选择,筛选出了一批综合农艺性状良好的抗白粉病新品系,为高产抗病新品种的选育奠定了基础。

7 展望

在基因的多项研究中,‘Ulka’()、KM2939()、‘鸟麦’()、CH1357、‘良星66’和‘农大399’对不同白粉病菌株表现出了不同的抗性反应差异,但序列分析表明它们所携带的抗病基因序列完全一致。出现这种情况的可能原因包括:1)这些材料的遗传背景存在较大的差异,例如‘鸟麦’是中国农家品种,‘良星66’和‘农大399’是育成品种等。2)该基因在不同的遗传背景下可能存在其他相关调控因子,共同决定它们对白粉病菌株的抗性。3)白粉病菌本身是高度杂合异质混合群体,与抗病基因对应的毒性基因位点可能不是单一的纯合状态,导致出现不同的鉴定结果。因此,要反复验证比较其抗性反应,确认抗性反应的差异能稳定遗传。同时,在不同材料背景下进一步研究的转录、蛋白翻译及表观修饰,解析其作用机制,明确小麦抗病基因及其与寄主之间的互作关系。

在目前已正式命名的抗白粉病基因中,虽然不乏抗性优异的基因,但是真正能被应用到育种中的抗病基因相对较少。究其原因,一是随着病原菌的变异,其抗性被克服; 二是抗病基因的载体品种农艺性状太差不宜直接作为育种亲本利用; 三是部分抗病基因来源于小麦的近缘属种,多以抗病附加系、代换系或易位系的形式存在,多与不利性状基因连锁,需要打破连锁累赘后才能用于育种。作为生产上常用的抗白粉病基因,其抗性表现优异,同时载体材料的综合农艺性状较好,因而在生产上得到了广泛应用。例如大面积推广的‘济麦22’ ‘济麦23’‘良星66’ ‘良星99’以及它们的衍生品种(系)等。但是,需要注意的是,当前在育种上,越来越多的杂交组合都以大面积推广的主栽品种为亲本,从而使得新培育的品种(系)间遗传相似性不断提高,导致遗传基础狭窄。随着2 在生产上利用频率的提高,其对应的毒性菌系的频率也在不断上升,导致抗性被克服的风险不断加大。因此,在抗病育种上应当合理布局利用该基因,运用分子标记辅助选择将不同抗性的基因聚合使用,这样不仅可以弥补不同抗病基因间的差异,还能延长抗病基因的使用寿命,使抗病表现更加持久。此外,系统鉴定现有的抗性资源,深入发掘新的抗病基因及其优异等位变异,丰富抗源的遗传多样性,大力加强种质资源的原始创新,以保持小麦新品种培育和生产的可持续发展已成为小麦抗病育种急需解决的重要问题。