藏药兔耳草常用基原的ITS2序列鉴定研究

高必兴，齐景梁，钟 红，马璐琳，李 倩，连 艳，蒋桂华*，蒋运斌

藏药兔耳草常用基原的ITS2序列鉴定研究

高必兴1, 2，齐景梁2，钟 红4，马璐琳4，李 倩2，连 艳1，蒋桂华1*，蒋运斌3*

1. 成都中医药大学药学院，四川 成都 611137 2. 四川省药品检验研究院 国家药品监督管理局中成药质量评价重点实验室，四川 成都 611731 3. 西南大学药学院/中医药学院，重庆 北碚 400715 4. 成都市郫都区中医医院，四川 成都 611730

利用DNA条形码内转录间隔区2（internal transcribed spacer 2，ITS2）序列针对自采及流通使用环节的不同基原兔耳草进行分析，建立一种快速鉴定常用兔耳草的方法，并分析市场流通的主流品种。采用试剂盒提取101份兔耳草样品的DNA，针对其ITS2片段进行PCR扩增并双向测序，获取ITS2序列信息；并从GenBank上下载相关序列28条。运用MEGA6.0对129条ITS2序列进行比对分析，计算种内和种间K2P遗传距离，构建邻接法（neighbor-joining，NJ）系统进化树，并预测ITS2二级结构。采用BLAST法及NJ聚类分析法分析市场流通兔耳草基原。除四川部分区域所产全缘兔耳草与革叶兔耳草种间亲缘关系近外，短筒兔耳草、全缘兔耳草、圆穗兔耳草、革叶兔耳草、短穗兔耳草及紫叶兔耳草的种内最大遗传距离均小于种间最小遗传距离，具有明显的条形码间距。系统进化树显示短筒兔耳草、圆穗兔耳草、短穗兔耳草及紫叶兔耳草单独聚为一支，四川部分区域所产全缘兔耳草与革叶兔耳草聚为一支，其余全缘兔耳草聚为一支。通过ITS2二级结构发现，各基原兔耳草在茎环数目、大小及位置均有一定差异，可区分亲缘关系近的全缘兔耳草与革叶兔耳草。市场分析显示，市面上流通的兔耳草有6种基原，以全缘兔耳草使用占比最高，短筒兔耳草次之，短穗兔耳草及圆穗兔耳草较低，紫叶兔耳草及革叶兔耳草最低。ITS2序列可以作为DNA条形码用来鉴别常用藏药兔耳草的基原，市场主流兔耳草品种为全缘兔耳草、短筒兔耳草及短穗兔耳草。

兔耳草；ITS2序列；短筒兔耳草；全缘兔耳草；圆穗兔耳草；革叶兔耳草；短穗兔耳草；紫叶兔耳草；主流品种

藏药“兔耳草”基原之一的短筒兔耳草Maxim.收载于《中国药典》2020年版一部，藏文音译名为“洪连”，药用部位为全草，应用广泛，药用价值高，具有清热、解毒、利湿、平肝、行血、调经等功效，可用于发热烦渴、肺热咳嗽、头痛眩晕、湿热黄疸、月经不调、药食中毒等证[1]，主要分布于我国青海省。通过前期调研发现，市售及临床使用的兔耳草除短筒兔耳草外，还有多种兔耳草属植物均被使用[2]，但目前传统鉴别方法难以将其区分，无法了解市场总体的兔耳草使用情况，因此亟待一种有效的鉴别方法将其区分。

DNA分子鉴定技术是利用基因组中一段公认标准的、相对较短的DNA片段来进行物种鉴定的分子诊断技术，不依赖物种的形态特征和分类经验[3]。《中国药典》2020年版四部通则收载了中药材 DNA 条形码分子鉴定法指导原则，其中内转录间隔区2（internal transcribed spacer 2，ITS2）作为中药材鉴定的标准DNA条形码[4]。现兔耳草的研究多集中在成分[5-6]、指纹图谱[2]、药理[7]等方面，鲜见兔耳草DNA条形码的相关报道。本研究以DNA条形码ITS2序列为基础，对所收集的样品和网站下载的相关ITS2序列进行研究分析，以期建立一种快速准确的鉴别方法，为兔耳草品种的鉴别及使用提供科学依据。

1 仪器与试药

C1000型聚合酶链式反应（PCR）仪、PowerPac Basic型电泳仪、Gel Doc XR+型全自动凝胶成像系统（Bio-Rad公司）；XP205型电子分析天平（Mettler Toledo公司）；MM400型球磨仪（Retsch公司）；MiniSpin型高速离心机（Eppendorf公司）；Milli-Q Advantage A10型纯水仪（Millipore公司）；植物基因组DNA提取试剂盒、2×Taq Master Mix缓冲液、Gene Red核酸染料（天根生化科技有限公司）；Taq酶PCR扩增试剂盒（北京聚合美生物科技有限公司）；琼脂糖（Biowest公司）；ITS2引物（ITS2F：5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′；ITS3R：5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′）由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

收集兔耳草相关样品共计101批次，其中自采42批，购买59批，经四川省药品检验研究院黎跃成主任中药师鉴定为全缘兔耳草W. W. Smith、革叶兔耳草W. W. Smith、短筒兔耳草Maxim.、短穗兔耳草Maxim.、紫叶兔耳草W. W. Smith、圆穗兔耳草Batalin，样品来源见表1。同时于GenBank数据库中下载28条ITS2序列，包括全缘兔耳草7条，革叶兔耳草2条，短筒兔耳草3条，短穗兔耳草14条，紫叶兔耳草1条，圆穗兔耳草1条。ITS2序列信息见表2。

2 方法

2.1 DNA提取

用75%乙醇擦拭样品表面，自然晾干后，用球磨仪研磨成粉末，称取粉末约30 mg，按照植物基因组DNA提取试剂盒说明书（天根生化科技有限公司）进行操作，提取DNA，−20 ℃保存备用。

2.2 PCR扩增及测序

选取通用引物F（5′-ATGCGATA- CTTGGTGTGAAT-3′）和R（5′-GACGCTTCT- CCAGACTACAAT-3′）对样品DNA进行扩增。反应体系为50 μL，包含2×Taq Master Mix缓冲液25 μL、上下游引物各2 μL、DNA模板5 μL，加灭菌超纯水至50 μL。阴性对照为无模板DNA的反应体系。以10 000 r/min离心（离心半径为3 cm）5 s后，置于PCR仪中。反应程序为95 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s、56 ℃退火30 s、72 ℃延伸45 s，35 个循环；72 ℃延伸5 min。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测以确定成功率及目的条带片段大小，扩增产物委托生工生物工程（上海）股份有限公司进行双向测序。

表1 不同基原兔耳草样品信息

Table 1 Sample information sheet of different origins of Lagotidis Herba

编号基原来源获取方式 HL-1全缘兔耳草德格县藏医院购买 HL-2宗萨藏医院购买 HL-3石渠县藏医院购买 HL-4四川省甘孜州石渠县络须镇第一个垭口自采 HL-5四川省甘孜州石渠县络须镇分叉口前行雪山自采 HL-6乡城县藏医院购买 HL-7甘孜州药检所购买 HL-8宇妥藏药（批次201806）购买 HL-9四川省甘孜州石渠县德荣马乡自采 HL-10凉山州木里藏族自治县中藏医院购买 HL-11得荣藏医院购买 HL-12阿坝县藏医院购买 HL-13阿坝州藏医院购买 HL-14若尔盖藏医院购买 HL-15白玉县藏医院购买 HL-16理塘县藏医院购买 HL-17居麦旁藏药购买 HL-18青海果洛州藏医院购买 HL-19青海省海东市乐都区自采 HL-20青海省囊谦县藏医院购买 HL-21金珂藏药购买 HL-22青海省黄南州藏医院购买 HL-23青海省玉树藏族自治州藏医院购买 HL-24青海省八一路药材市场购买 HL-25青海省班玛县藏医院购买 HL-26西藏拉萨蓝屋石药材公司购买 HL-27西藏药检所购买 HL-28西藏诺迪康药业有限公司购买 HL-29西藏山南市错那县波拉山自采 HL-30西藏自治区拉萨市墨竹工卡县思金拉错自采 HL-31西藏藏医学院藏药有限公司购买 HL-32西藏错那雷达站自采 HL-33西藏拉萨市当雄县羊八井镇雪古拉山自采 HL-34西藏自治区拉萨市墨竹工卡米拉山自采 HL-35红原藏医院购买 HL-36云南药检所购买 HL-37四川省甘孜州理塘县兔耳山垭口自采 HL-38四川省甘孜州雅江县柯拉山上自采 HL-39四川省甘孜州理塘县拉波乡拉德村自采 HL-40四川省甘孜州理塘县藏坝乡自采 HL-41四川省甘孜州稻城海子山垭口自采 HL-42四川省甘孜州藏医院自采 HL-43四川省甘孜州巴塘县海子山姐妹湖自采 HL-44四川省甘孜州理塘县拉波乡拉美村自采 HL-45四川省甘孜州巴塘县海子山垭口自采 HL-46四川省甘孜州雅江县垭口前行3 km自采 HL-47革叶兔耳草云南省迪庆州白马雪山第一垭口自采 HL-48云南省迪庆州白马雪山第二垭口自采 HL-49迪庆藏医院购买 HL-50甘南州藏医院购买 HL-51四川阿坝年宝叶则自采 HL-52西藏自治区拉萨市墨竹工卡县思金拉错自采

续表1

表2 不同基原兔耳草ITS2序列的GenBank登录号信息

Table 2 GenBank login number information of ITS2 sequence for different origins of Lagotidis Herba

名称GenBank登录号 全缘兔耳草KC413431.1、KC413433.1、KC413434.1、KC413435.1、KJ630574.1、KU508311.1、KU508316.1 革叶兔耳草KC413410.1、KC413411.1 短筒兔耳草KC413418.1、KC413420.1、KU508315.1 短穗兔耳草AF313027.1、KC413414.1、KC413415.1、KC413416.1、KC413417.1、KU508310.1、KU508312.1、KU508313.1、KU508314.1、OK275352.1、OK275354.1、OK275355.1、OK275356.1、OK275357.1 紫叶兔耳草AF313029.1 圆穗兔耳草KC413445.1

2.3 数据分析

应用CodonCode Aligner V6.0对测序所获得的数据进行校对拼接，去除引物及低质量区，基于隐马尔科夫模型（HMMer）的注释方法去除5.8 S和28 S区段，即可获得ITS2序列信息。

采用BLAST法进入美国国家生物技术信息中心（NCBI，https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.Cgi）和中药材DNA条形码鉴定系统（http://barcode. ndctcm.org/china/），应用相似性搜索法[10]对实验样品的不同单倍型序列进行BLAST鉴定分析。

应用MEGA6.0软件进行序列比对，对序列的变异位点进行分析，不同物种的单倍型为A1、B1，同一物种存在变异位点的单倍型为A1、A2；并基于K2P模型计算种内、种间遗传距离，利用邻接法（neighbor-joining，NJ）构建系统聚类树，同时以Bootstrap自展支持率（1000次）重复检验各分支的支持率。

登录http://its2.bioapps.biozentrum.uni-wuer- zburg.de/，对不同物种的主导单倍型进行ITS2二级结构的预测。

3 结果与分析

3.1 序列信息分析

短筒兔耳草、短穗兔耳草、紫叶兔耳草及圆穗兔耳草的ITS2序列长度均为202 bp，全缘兔耳草与革叶兔耳草的ITS2序列长度为203 bp。所有样品GC量为59.4%～62.7%，平均GC量为61.02%。6种兔耳草间存在32个变异位点，种内革叶兔耳草、紫叶兔耳草及圆穗兔耳草的ITS2序列变异较小，不存在变异位点，形成1个单倍型；全缘兔耳草、短筒兔耳草、短穗兔耳草ITS2序列分析分别存在7、3、2个种内变异位点，分别形成5、3、2个单倍型。

3.2 K2P遗传距离分析

短筒兔耳草、全缘兔耳草、革叶兔耳草、短穗兔耳草、紫叶兔耳草及圆穗兔耳草种内和种间遗传距离见表3，结果显示，除全缘兔耳草与革叶兔耳草种间与种内遗传距离有部分重合外，种内最大遗传距离0～0.015；除全缘兔耳草与革叶兔耳草外，种间最小遗传距离0.016～0.023，种内最大遗传距离远小于种间最小遗传距离，具有明显的条形码间距（barcoding gap），说明K2P距离可很好地区分开此6种兔耳草，但无法完全区分全缘兔耳草与革叶兔耳草。

表3 不同基原兔耳草的种内种间遗传距离分析

Table 3 Analysis of intraspecific and interspecific genetic distances of different origins of Lagotidis Herba

物种种内（种间）遗传距离 短筒兔耳草全缘兔耳草短穗兔耳草圆穗兔耳草革叶兔耳草紫叶兔耳草 短筒兔耳草00.028（0.026～0.041）0.028（0.026～0.035）0.037（0.029～0.045）0.029（0.026～0.035）0.029（0.026～0.035） 全缘兔耳草0.028（0.026～0.041）00.033（0.029～0.045）0.043（0.038～0.051）0.003（0.006～0.011）0.034（0.032～0.042） 短穗兔耳草0.028（0.026～0.035）0.033（0.029～0.045）00.035（0.029～0.042）0.029（0.029～0.033）0.026（0.025～0.029） 圆穗兔耳草0.037（0.029～0.045）0.043（0.038～0.051）0.035（0.029～0.042）00.041（0.038～0.045）0.016（0.016～0.023） 革叶兔耳草0.029（0.026～0.035）0.003（0.006～0.011）0.029（0.029～0.033）0.041（0.038～0.045）00.032 紫叶兔耳草0.029（0.026～0.035）0.034（0.032～0.042）0.026（0.025～0.029）0.016（0.016～0.023）0.0320

3.3 聚类分析

基于ITS2序列构建兔耳草及其易混品间的NJ系统聚类树，Bootstrap 1000次重复，支上数值仅显示自展支持率≥50%，见图1。可以看出，除全缘兔耳草与革叶兔耳草外，各物种均能以大于50%的自展支持率各自聚为1支，表现出了良好的单系性。四川甘孜所产全缘兔耳草均与革叶兔耳草聚为一支，其他均单独聚为一支。

3.4 ITS2二级结构分析

因全缘兔耳草聚成了2类，故分别建立其二级结构，根据ITS2二级结构预测数据库网站得到7类兔耳草（短筒兔耳草、全缘兔耳草I类、全缘兔耳草II类、革叶兔耳草、短穗兔耳草、紫叶兔耳草及圆穗兔耳草）的二级结构模型，见图2。通过茎环数目、大小及位置能有效区分，分析结果如下：均为典型的1环4臂结构，即1个中心环（主环）及4个螺旋区（helix），每个螺旋上又有大大小小、或多或少的茎环（loop）结构，其中螺旋III最长。

通过茎环数目（表4）可区分短筒兔耳草、短穗兔耳草、紫叶兔耳草及圆穗兔耳草，但无法区分全缘兔耳草I类、全缘兔耳草II类及革叶兔耳草。但通过茎环的大小及位置可以区分三者，螺旋I中三者均具有3环，但全缘兔耳草I类第一环大小大于第2环及第3环，全缘兔耳草II类与革叶兔耳草3环大小相似，但在螺旋III中全缘兔耳草II类第一环大小大于其余3环，而革叶兔耳草4环大小相似，能将其区分。

图1 基于ITS2序列构建不同基原兔耳草的NJ树

图2 不同基原兔耳草的ITS2二级结构

表4 不同基原兔耳草的茎环数目

Table 4 Number of stem loops of different origins of Lagotidis Herba

基原茎环数目 螺旋I螺旋II螺旋III螺旋IV 短筒兔耳草2241 全缘兔耳草（I类）3241 全缘兔耳草（II类）3241 短穗兔耳草2241 圆穗兔耳草2221 革叶兔耳草3241 紫叶兔耳草2221

3.5 不同基原兔耳草在市场中的使用情况

针对购买的兔耳草样品（59批），基于NCBI的BLAST鉴定结果和NJ系统聚类树分析结果表面，6种兔耳草均有使用，以全缘兔耳草（27批，占总批次的45.8%）占比最高，短筒兔耳草（16批，占总批次的27.1%）次之，短穗兔耳草（7批，占总批次的11.9%）及圆穗兔耳草（6批，占总批次的10.2%）较低，紫叶兔耳草（1批，占总批次的1.7%）及革叶兔耳草（2批，占总批次的3.4%）最低。

4 讨论

传统的鉴别方法难以将6种兔耳草的基原完全的区分，故使用《中国药典》2020年版四部通则[4]收载的中药材DNA条形码分子鉴定法指导原则的ITS2作为该药材鉴定的方法。其不受个体形态特征和完整性的影响，方法易于统一、标准化，是传统鉴定方法的有效补充[10]，同时本研究在ITS2一级核酸序列的基础上，对其二级结构也进行了预测，ITS2二级结构是由RNA中的核苷酸在氢键作用下发生碱基互补配对，导致自身回折形成的茎环结构，是实现细胞功能的结构基础，包含着额外的系统发育信息[11]，可以作为DNA条形码鉴别中药材的辅助手段。结合ITS2一级结构与二级结构的分析可以区分此6种基原。此方法可用于洪连基原种的鉴别，无疑是对洪连资源的合理开发与利用有着非常重要的价值。

本研究通过聚类分析及K2P遗传距离分析可知，全缘兔耳草与革叶兔耳草的亲缘关系非常近；紫叶兔耳草及圆穗兔耳草亲缘关系也近，以大于50%的置信度聚为一支，同时有着所有种最低的种间遗传距离（0.016～0.023）。同时通过聚类分析还发现，中国植物志中归属于兔耳草属分萼组的短穗兔耳草、紫叶兔耳草及圆穗兔耳草以97%的置信度聚为一大支，归属于兔耳草属合萼组的短筒兔耳草、全缘兔耳草及革叶兔耳草以83%的置信度聚为一大支，从分子生物学的角度验证了其归属的可信度。

市场使用情况分析可知，以国家药品标准收载的短筒兔耳草及全缘兔耳草使用得最为普遍，地方标准收载的短穗兔耳草、圆穗兔耳草及革叶兔耳草的使用次之，未被标准收载的紫叶兔耳草使用的最低。有必要增加紫叶兔耳草的质量标准研究，规范其用药的安全及有效性。同时从自采的批次（短筒兔耳草8批、全缘兔耳草19批、革叶兔耳草4批、短穗兔耳草3批、紫叶兔耳草4批及圆穗兔耳草4批）也可以看出，全缘兔耳草的资源较其他资源更为丰富，短筒兔耳草现为国家保护植物，常年的采摘导致其资源的匮乏，以资源更为丰富的全缘兔耳草来代替短筒兔耳草，以缓解其资源的劣势。

综上所述，DNA分子鉴定技术的ITS2序列可鉴别市场中常见的6种兔耳草，其中短穗兔耳草又作为药材“志达萨增”使用，其收载的功效均与传统的洪连相悖[12-15]；同时圆穗兔耳草、短管兔耳草及紫叶兔耳草同属于“雄洪连”，全缘兔耳草与革叶兔耳草属“雌洪连”，雄洪连的临床疗效优于雌洪连[2]，但现有研针对此6种兔耳草的化学成分和药效学研究甚少[9]，仍需进一步深入研究，为其资源的合理开发及使用奠定了基础。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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Identification of commonly used origins of Tibetan medicinebased on ITS2 barcode and market analysis

GAO Bi-xing1, 2, QI Jing-liang2, ZHONG Hong4, MA Lu-ling4, LI Qian2, LIAN Yan2, JIANG Gui-hua1, JIANG Yun-bin3

1. School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China 2. Sichuan Institute for Drug Control/Key Laboratory of Quality Evaluation of Chinese Patent Medicines, NMPA, Chengdu 611731, China 3. College of Pharmaceutical Sciences and Chinese Medicine, Southwest University, Chongqing 400715, China 4. Chengdu Pidu District Hospital of TCM, Chengdu 611137, China

To establish a rapid method to identify different origin offrom self-harvesting and distribution samples based on ITS2 sequences of DNA barcode technology, and analyze the mainstream varieties in the market.The DNA of 101samples was extracted by using the Plant Genomic DNA Extraction kit, and then their ITS2 sequence was amplified by PCR and sequenced in both directions to obtain the information of ITS2 sequence; Meanwhile, 28 related sequences were downloaded from GenBank. Subsequently, 129 ITS2sequenceswere analyzed by MEGA6.0, and the intra- and inter- specific K2P genetic distances were calculated to construct aneighbor joining (NJ) phylogenetic treeand predict the secondary structure of ITS2. The origins ofin circulation samples were analyzed by the BLAST and NJ cluster analysis methods.The results showed that the maximum intraspecific genetic distance was far less than the minimum interspecific genetic distance among,,,,and, exceptfrom some areas of Sichuan and, indicating there were an obvious barcoding gap among them. The NJ tree showed that,,andshared respectively a clade, andfrom some areas of Sichuan andshared a clade, and othershared a clade. ITS2 secondary structures for six kinds ofwere significantly different enough to identifyand, and the difference were the number, size and location of the stem ring. Market analysis showed that the usage rate of different origins of L. herba from high to low was,and,.The ITS2 sequence can be used as DNA barcode to identify the origins ofaccurately and quickly. Market mainstream varieties were,and.

; ITS2 barcode;Maxim.;W. W. Smith;Batalin;W. W. Smith;Maxim.;W. W. Smith; mainstream varieties

R286.12

A

0253 - 2670(2022)21 - 6857 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.21.024

2022-03-06

国家食药监总局药化司专项“特色民族药材检验方法示范性研究”；四川省药品监督管理局科技计划项目（2021002）；国家自然科学基金项目（82173928）；四川省科技厅应用基础计划课题（2020YJ0369）；四川省中医药管理局项目（2021MS022）；四川省民族药标准提升项目（510201202200504）

高必兴，男，主管中药师，主要从事中药及民族药质量研究。E-mail: laughgao@foxmail.com

蒋桂华，女，教授，博士生导师，主要从事中药及民族药学研究。Tel: 18980923782 E-mail: 11469413@qq.com

蒋运斌，男，讲师，主要从事民族药学研究。E-mail: yunbinjiang@swu.edu.cn

[责任编辑 时圣明]