不同种类离子对DNA凝聚影响的研究

孔令轩,王艳伟,杨光参

温州大学 数理学院,浙江 温州 325035

DNA是所有生物细胞内携带的能合成RNA和人体所需蛋白质的一种核酸,是生物体发育和正常运作必不可少的生物大分子,是人体遗传信息的载体[1]。先前的研究表明,当一个带正电的分子与带负电的DNA链结合时,会导致DNA折叠和凝聚[2]。研究DNA折叠和凝聚的基本机制可以进一步的了解如何建立DNA纳米结构。DNA凝聚在不同领域有着不同的研究方向,在生物化学、生物物理学和分子生物学中,它代表了遗传信息被包装和保护的过程；在高分子物理学和凝聚态物理学中,它出现了耐人寻味的相变、液晶行为和聚电解质的问题；在生物技术和医学中,它提供了一种有希望的手段,使含有治疗性基因的DNA可以从溶液中转移到目标细胞中,从而达到基因治疗的目的[3]。因此,DNA凝聚不仅对生物系统中遗传物 质的包装过程很重要,而且在人工基因传递方面也有潜在的治疗应用[4]。

近年来,国内外已经有很多研究人员对DNA凝聚进行研究。Aich等[5]研究发现,二价金属阳离子可以和DNA形成金属-DNA(Metal-DNA,M-DNA)结构,该结构具有分子线的性质,可以被用作操纵自组装的电子电路。Hibino等[6利用单分子技术研究了碱金属离子(Li+、Na+、K+、Rb+和Cs+)对亚精胺诱导的DNA凝聚的保护作用,发现所有碱金属盐都能阻止DNA的凝聚,其中Na+比其他碱金属离子更能阻止DNA的凝聚。Tongu等[7]通过原子力显微镜(AFM)直接观察到二价金属离子(Mg2+和Ca2+)会对由亚精胺诱导的DNA凝聚起抑制作用。Froehlich等[8]利用傅里叶变换红外光谱(FTIR)、紫外可见光光谱(UV visible)、荧光光谱和AFM等方法测定了聚乙二醇(PEG)对DNA的大小和DNA凝聚构象的影响。李聪聪等[9]通过动态光散射(DLS)和AFM手段,观察到了-1价至-3价的阴离子会对由精胺诱导的DNA凝聚有一定的抑制作用。

在溶液中,DNA的凝聚程度可能高度依赖于阳离子的价态[10]。现阶段,已经有研究表明二价金属阳离子与DNA结合是定点结合的方式[11]。然而不同种类的离子对DNA凝聚的影响尚还需进一步研究。精氨酸作为一种典型的阳离子短肽,经常被用于研究治疗各类肝昏迷及病毒性肝类谷丙转氨酶异常的疾病[12]。对于阴离子对DNA凝聚的影响,有研究者已经通过计算模拟的方法,讨论了不同价态的阴离子对DNA-精胺凝聚复合体表面电荷的变化影响,发现阴离子对DNA凝聚起到抑制作用[13-14]。本实验运用了单分子实验中的磁镊(MT)和AFM分别测量了在不同阴离子(硫酸根,柠檬酸根,焦磷酸根)以及阳离子短肽(聚三精氨酸,聚四精氨酸,聚八精氨酸)存在对DNA凝聚力及凝聚形态的影响,发现DNA的凝聚力及凝聚程度随着阳离子价态的升高而增强,而阴离子对DNA凝聚起到抑制作用,使发生凝聚的DNA再次发生解凝聚。总之研究阴阳离子对DNA凝聚力的影响,可以更好的了解DNA的凝聚及解凝聚的发生,及在纳米尺度上精细地控制DNA的构象形状,对基因治疗提供一定的指导,例如:药物输送、生物传感和合成纳米孔形成等,同时可以为一些离子的识别提供可能的方案,对生物传感器的设计提供依据。

1 实验材料与方法

1.1 实验材料

双链λ-DNA(购自New England Biolabs);三羟甲基胺基甲烷(Tris),氯化精胺(C10H24N4Cl4),无水硫酸钠( Na2SO4),柠檬酸钠(C6H5Na3O7),焦磷酸钠(Na4P2O7)购自美国Sigma-aldrich公司,纯度>99%。聚三精氨酸(polyR3,R3),聚四精氨酸(polyR4,R4),聚八精氨酸(polyR8,R8)从吉泰肽业公司定制购入,纯度98.86%,去盐。配制10 mg/mL的母液,在使用时稀释到相应浓度。其余的离子溶液的缓冲液均为10 mmol/L的Tris。

1.2 磁镊的原理及操作

实验采用自搭建的磁镊平台[15],其主要的组成部分已经在图1中列出,核心部件为倒置显微镜,显微操纵仪以及控制系统。连接好小磁球的 DNA被固定到自制的玻璃微槽,通过显微操纵仪控制的永磁体对小磁球施加一个横向的拉力,利用25 帧的 CCD 记录整个实验过程中小磁球的运动轨迹,最后通过分析运动轨迹进而得出DNA长度与时间的关系,溶液不同,长度与时间的关系不同。

图1 单分子磁镊装置示意图

1.3 原子力显微镜原理及操作

原子力显微镜(德国JPK公司Nano Wizard 3)的组成及工作原理如图2所示[16],使用的工作模式为轻敲模式(AC Mode)。实验过程中将云母片切成1 cm×1 cm的正方形,用磨砂胶带新解离云母片备用；然后取30 μL测量溶液置于云母片上,沉积3 min；其次用超纯水清洗15次后用氮气吹干；最后置于常温干燥箱24 h后观察成像。

图2 原子力显微镜工作原理图

2 实验结果

2.1 不同价态阳离子与DNA作用后的力谱图像

了解不同离子对DNA凝聚力的差异性可以更好地了解DNA的特性,对某些疾病发生的机理也可以提供参考。我们使用MT和AFM进行实验,分别测量DNA在不同价态的阳离子和阴离子作用下,凝聚力的变化情况以及DNA的构象变化。首先在MT实验中,溶液中存在不同阳离子R3+、R4+以及R8+时,DNA凝聚力的变化情况不同。分别通入了190 μmol/L的R3+,142.5 μmol/L的R4+,这样可以保证阳离子的浓度均为570 μmol/L。值得注意的是,我们发现,通入浓度仅为2.15 μmol/L的R8+时,DNA凝聚力已经明显高于R3+和R8+。如图3,对比图(a)和图(b),我们可以看出,在通入190 μmol/L的R3+时,测得DNA凝聚力Fc=2.5 pN,当溶液中通入142.5 μmol/L的R4+时,DNA凝聚力则变为3.1 pN,可以看出,同样浓度的R4+比R3+导致DNA凝聚的效果更强。而在溶液中通入2.15 μmol/L时R8+时,DNA凝聚力就已经变为8.9 pN(图c),远大于溶液中加入190 μmol/L的R3+和142.5 μmol/L R4+时DNA的凝聚力,可见R8+在DNA的凝聚效果上更显著。

(a)190 μmol/L Poly R3；(b)142.5 μmol/L Poly R4；(c)2.2 μmol/L Poly R8图3 不同价态阳离子,MT测得DNA力谱图像

2.2 阳离子价态影响DNA构象的AFM图像

为了直观观察阳离子价态变化对DNA构象的影响,我们用AFM观察三个价态的聚精氨酸(R3+、R4+和R8+)对DNA凝聚效果的影响,实验中探究了能够发生DNA凝聚的不同离子的临界初始浓度,发现R3+导致DNA凝聚的初始浓度95 μmol/L,如图(a),R4+导致DNA凝聚的初始浓度为14 μmol/L,如图(b),R8+导致DNA凝聚的初始浓度为0.35 μmol/L左右,如图(c),可见价态越高,发生凝聚需要的浓度越小,说明价态越高,对DNA的凝聚效果越强,该结论与磁镊结果一致。

(a)浓度为95 μmol/L的R3+；(b)浓度为14 μmol/L的R4+；(c)浓度为0.35 μmol/L的R8+图4 不同价态影响DNA构象的AFM图像

2.3 不同价态阴离子与DNA作用后的力谱图像

结果如图5,在都加入了5 mmol/L氯化精氨作为凝聚剂时,加入不同价态的阴离子后,凝聚力(从图a～d)分别为3.7、3.1、2.2、1.6 pN。可以看出,随着阴离子价态的升高,DNA凝聚力逐渐在减少,这意味着阴离子对DNA凝聚起着抑制作用且随着价态的升高,抑制的能力也逐渐增强。

图5 不同价态阴离子作用下,MT测得DNA力谱图像变化情况

2.4 不同价态的阴离子对DNA构象的影响

为了直接观察阴离子价态的变化对DNA凝聚抑制的影响,我们使用原子力显微镜观察在不同价态的阴离子作用下,DNA构象的变化,在都存在0.1 mmol/L的精胺溶液中分别加入了15 mmol/L的Na2SO4,10 mmol/L的Na3C6H5O7以及7.5 mmol/L的Na4P2O7,这样,可以保证在阴离子的浓度不变的前提下,比较阴离子的价态的变化对DNA凝聚抑制的影响。

结果如图6,可以看到,(a)仅有0.1 mmol/L的Spermine作为对比,由(b)到(d)分别对应-2、-3和-4价所对应的DNA的构象分别从非常紧密的结构到逐渐松散的状态,直到最后为-4价时,DNA表现为松散的毛线状态,得到的结果与磁镊结果得到一致的结论,即随着阴离子价态的升高,DNA凝聚抑制越明显。

(a)至(d)均有0.1 mmol/L Spermine作为凝聚剂,(a)0.1 mmol/L Serpmine;(b)15 mmol/L Na2SO4;

3 讨 论

如图7所示的一种模型可以解释阳离子价态影响DNA的凝聚的差异性,为更好的描绘作用过程,选取一个松散的DNA的片段,在带三个电荷的R3附近,由于DNA的磷酸基团带负电,与R3所带的正电荷因经典相互作用而相吸引,随着价态的增加,带正电荷的数量也在增长,静电力也逐渐变大,这促使DNA逐渐弯曲。由于溶液中的聚精氨酸离子非常多,DNA就会逐渐呈现凝聚状态,这与我们的MT实验以及AFM实验所得到的结论也是一致的。

图7 不同价态的阳离子短肽与DNA作用模型

对于阴离子价态影响DNA凝聚的差异性如图8所示的模型图,由于在阳离子溶液中加入阴离子后,阴离子会优先和溶液中的阳离子相结合,而随着价态的提高,阴离子与阳离子结合的能力也越强,这也使得溶液中阳离子与DNA的结合位点变少,也就导致了DNA凝聚逐渐随着阴离子价态的升高而变弱。

(a)～(d)均有浓度相同的精胺,(a)仅存在精胺;(b)加入了-2价阴离子;(c)加入了-3价阴离子;(d)加入了-4价阴离子图8 不同价态的离子短肽与DNA作用模型

4 结 论

通过MT实验进行力谱分析以及AFM直接观察到的DNA构象,可以看出,随着阳离子价态的升高,DNA凝聚力也随之逐渐升高,而AFM实验也验证了这一现象,随着价态的升高,DNA凝聚变得更强,由松散状态逐渐收缩凝聚,由于阳离子在溶液中会将DNA表面电荷中和,使得DNA发生凝聚,随着阳离子的价态增高,与DNA表面电荷结合的位点也越多,使得DNA凝聚效果更强。同时考虑阴离子在DNA凝聚中的影响,在DNA-精胺复合体中加入不同价态的阴离子,发现DNA的凝聚力和凝聚程度随着阴离子价态的升高逐渐变小变弱,说明阴离子对DNA凝聚有抑制作用。