mNGS 应用于肺部感染患者病原学检测中的研究进展

周茂旗 李兴明 王宪刚 陈皓楠 张 永

1.成都医学院，四川成都 610500；2.四川省内江市第一人民医院呼吸与危重症医学科，四川内江 641000

宏基因二代测序（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）是临床上一种新兴的病原检测方式，其采用的是半导体芯片测序技术，将碱基对合成核酸链的过程转化为数字信息，将待测的DNA链固定在半导体芯片微孔中的微球上，随后依次掺入ACGT 碱基，符合配对的碱基与待测DNA 链形成化学键，释放出氢离子，通过检测H信号的变化获得序列碱基信息，将生成序列碱基信息连接到精确的参考基因组数据库，以识别检出病原体。

PDC-seq病原微生物宏基因组检测是通过对生物样本中提取的核酸进行高通量测序，利用生物信息学进行比对分析，获取样本中包含的微生物种类和丰度信息，检测全面覆盖16000 多种病原体，包括细菌、真菌、病毒和寄生虫等。基于 Illumina 测序平台和 PCR-free 建库技术，可避免聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）引入的扩增偏向性和气溶胶污染，同时优化核酸提取，解决真菌和分支杆菌破壁难、检出率低等问题，在疑难危重感染病例中有较高的临床应用价值。

1 mNGS发展史

临床应用的元基因组学起源于2000 年初的微阵列，微阵列是一组微观特征（最常见的是DNA），用目标分子进行探测，以产生定量（基因表达）或定性（诊断）数据。随着微阵列技术在效率、识别力、敏感度和特异性方面的不断提高，已被应用于各种病原微生物的检测、鉴定、新病原体的发现、抗菌素耐药性监测和菌株分型，而后有学者在Affymetrix基因芯片平台上开发了重测序微阵列，应用于呼吸道病原体检测，可以同时检测和区分大量微生物病原体。直至2005 年二代测序技术的出现正式启动了元基因组学领域，此后，随着临床病原微生物检测的需求越来越大，mNGS 技术逐渐从实验室步入临床实践应用中。近年来mNGS 技术已成功应用于临床诊断新发病原体感染，如2013 年Wilson 等应用mNGS 技术在1 例不明原因发热、头痛的联合免疫缺陷男孩的脑脊液中首次检测出了神经型钩端螺旋体感染；2014 年Knittler 等研究者应用mNGS技术诊断了1 例由鹦鹉螺杆菌（传统常规微生物检测难以识别）引起的严重肺炎和多器官衰竭病例；2021 年四川省人民医院黄晓波团队用mNGS 诊断了1 例在感染早期迅速发展为严重急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）的患者，接受了体外膜氧合（extracorporeal membrane oxygenation，ECMO）治疗后，并发军团菌感染继发曲霉菌感染的病原体，目前为止，mNGS 技术在临床上的应用越来越广泛。

2 mNGS在病原学检测中的优势

肺部感染是一个全球性的健康问题，与高发病率、高死亡率以及不断增加的住院率相关。目前对于肺部感染的治疗多以经验性抗菌治疗为主，然而由于经验性治存在抗菌药物滥用、药物不良反应以及未能覆盖所有病原菌等风险，治疗不当易导致病情恶化，增加患者的死亡风险。由于不能快速诊断和区分呼吸道感染的病原体，抗生素的过度使用仍然是一个长期问题，因此快速准确识别病原体是合理治疗肺部感染的必要条件。我国肺炎患者并未常规进行呼吸道病毒筛查，在某些病毒感染病例中，mNGS 技术明确了其诊断，并进行了有效诊治。对于肺部感染患者，早期实施针对性的治疗，对提高患者生存率、改善患者预后尤为重要。临床上传统病原学微生物检测方法包括痰涂片及培养、血培养、PCR、抗原抗体检测等，痰培养是目前临床最常用的检测手段，然而痰培养存在阳性率低、培养周期长、部分病原体培养困难等局限，因此痰培养不能快速提供准确的病原体报告来指导临床科学合理的用药。mNGS 技术在病原微生物检测方面，以高效、快速、准确著称，其能快速提供呼吸道所有病原微生物检测报告，覆盖数据库中绝大部分病原微生物，尤其是对罕见和新生的微生物的检测 有着较高的效能，能很大程度上弥补传统检测的 不足。

2.1 mNGS 病原检测阳性率

mNGS 技术在肺部感染患者病原体检测的阳性检出率方面显著高于传统病原学检测方法。Wu 等进行的一项前瞻性研究中，纳入329 例成人重症社区获得性肺炎患者，完善支气管镜检测，获取等量肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）同时进行mNGS 检测和传统方法检测病原体，结果发现mNGS 检测组中304 例（99.24%）确定了病原体，mNGS 的总微生物检出率为90.3%，而传统检测方法病原检出率为39.5%（＜0.05）。另外Shi 等对110 例疑似肺结核患者的BALF 标本进行mNGS检测，并与BALF 或痰标本的常规微生物检测进行比较，结果mNGS 的敏感度（67.23%）明显高于培养（36.36%）、结核分枝杆菌PCR 检测（45.83%）、抗酸杆菌染色法（29.17%）；有研究发现，mNGS 测试的敏感度和特异性分别为79.2%（95.0%73.5%～85.2%）和90.6%（95%：87.3%～93.8%），这些研究结果充分证实了mNGS 技术在病原体检测阳性率方面较传统检测法的显著优势。

2.2 mNGS 病原体检测准确性

mNGS 技术应用于肺部感染患者能检测出标本中所有的病原微生物，相比传统检测方法检测范围更加广泛，对临床的诊断也更加准确、全面。有研究发现，mNGS 技术与结核分枝杆菌PCR 检测（Xpert）和培养法对结核分枝杆菌的检测结果的一致性较高，Kappa一致性分析的Kappa值分别为0.702（Xpert 法）和0.809（培养法）；mNGS 技术、Xpert法和培养法的特异性分别为 98.39%、98.39%和100%。Zhou 等进行了一项mNGS 技术检测肺炎患者BALF 病原体对肺炎的诊断和治疗的临床意义的多中心前瞻性观察研究，结果表明mNGS 检测结果与标准检测结果完全一致的有85 例（一致性为53.5%），64 例患者根据mNGS 结果调整了治疗方案（64 例积极影响病例）且明确诊断。总之，mNGS技术进行病原体检测的准确性方面较传统检测方法更高。

2.3 mNGS 病原体检测时效性

mNGS 技术应用于肺部感染患者病原体检测方面，相比传统检测方法耗时较少，能快速提供病原体报告，普通细菌培养一般需要48～72h，结核杆菌的培养至少需要4 周，支原体培养至少需要6 周。有研究显示，mNGS 在3d 内鉴定了119 例感染病例中的80 例（67.23%）病原微生物，这是外送检测的情况下。若在医院应用测序平台，检测时间将可能缩短到24h；而常规方法90d 的检出率为49.58%（59/119）；常规检测方法的平均反馈时间从1d 到60d 不等，Xpert 需要1d 左右，抗酸杆菌染色至少需要3d，真菌血清学试验通常需要5～7d，病原体培养平均反馈时间中细菌≥3d，真菌≥7d，分枝杆菌为42～60d。临床上大多数mNGS 检测报告时间为1～2d，甚至更快，充分证明了mNGS 技术在检测肺部感染患者病原体方面较传统检测方法耗时更少、更加快速。

3 mNGS病原学检测中的局限性

3.1 假阳性

mNGS 检测的多数读数（＞99%）来自人类宿主，因此限制了病原体检测的总灵敏度。宿主耗竭方法的使用与靶向测序不同，宿主耗竭方法旨在降低mNGS 读数中人类宿主背景序列的相对比例，而不是利用已知的病原体序列作为靶标，这种方法保留了宏基因组测序无偏见的优点，能检测出样本中所有的微生物，但不能分辨致病与否、污染与否，在样本采集过程中、检测样品、用于加工的试剂或实验室环境中均存在微生物的污染，因此检测结果存在假阳性可能，假阳性mNGS 结果可能会导致诊断错误和治疗无效。Zhou 等的研究中，mNGS 检测出1 例奇异变形杆菌感染，但该标准检测结果均为阴性，该患者接受了奇异变形杆菌肺炎的针对性治疗后疗效不佳，最终该病例被诊断为隐源性机化性肺炎，其是一种罕见的间质性肺部疾病，研究结果说明在临床上不能完全依靠mNGS 检测结果来作出诊断与治疗，还应参考患者其他辅助检查，结合患者临床表现与体征进行诊治。

3.2 mNGS 检测结果解释没有明确标准

目前许多检测公司对mNGS 检测结果的解释，并没有一个明确的标准。即使大家基本参照的是微生物基因数据库，然而不同机构的数据分析人员可能存在主观偏倚；微生物参考数据库也存在一些局限：①稀有病原体或新出现的不可知的病原体菌株的参考数据库不完整。②参考数据库偏向于某些临床常规的微生物。③某些重要的病原体核酸序列可能在遗传上相似（如分枝杆菌的种类）而难以区分。④受到正常定植微生物和引入试剂的核酸序列影响，使读数混；不同平台在处理数据时存在差异，在检测过程中的质量控制亦各有千秋。目前临床上尚无统一的标准流程，因此，不同平台的检测结果可能存在些许差异，临床医生在面对该检测报告时应谨慎思考，给予正确的诊治。

4 展望

mNGS 技术应用于肺部感染性疾病的病原体检测方面既有优势同时也存在局限。目前国内大部分医院尚未在院内开展mNGS 检测实验室，患者需检测mNGS，则需将样本外送基因公司或各大检测平台进行检测，这不仅加大了该项检测的经济成本，也增加了样本污染的机会，限制了该项技术的推广。然而即使存在局限，在临床上也应权衡利弊后做出科学合理的抉择，以免贻误患者病情。总之，mNGS技术在检测感染性疾病病原微生物方面的影响是积极的，总体发展趋势是向上的，相信在未来的不断发展中，mNGS 技术能造福于越来越多的患者，为医学发展做出显著贡献。