影响非洲猪瘟病毒检测结果的因素探析

何菊，李照伟，陈娟，李潇，罗元宇，董然然

（1.六盘水水城区动物疫病预防控制中心 贵州六盘水 553600；2.贵州省动物疫病预防控制中心 贵阳 550000；3.六盘水市农业科学研究院 贵州六盘水 553000；4.盘州市动物疫病预防控制中心 贵州六盘水 553537；5.贵州大学 贵阳 550000）

自2018 年8 月我国确诊第一例非洲猪瘟疫情以来，非洲猪瘟疫情在我国境内蔓延，为实现各级实验室非洲猪瘟病毒的快速检测并启动防控反应，农业农村部陆续开展兽医实验室非洲猪瘟病毒检测资质授权。而实验室非洲猪瘟病毒检测的准确性，对指导基层开展非洲猪瘟疫情防控起到关键性作用，实验室非洲猪瘟病毒检测技术的提升和检测能力的准确性是非洲猪瘟疫情能否得到快速控制的重要环节。因此，严格管控非洲猪瘟采样及实验室检测的各个环节，规避影响非洲猪瘟病毒检测结果，在对非洲猪瘟检测结果及时有效的应用到疫情防控工作中起到至关重要的作用。

1 样品因素

1.1 样品的采集

1）抗凝血采集和全血时，用含有EDTA 的真空采血管（紫色）或含有3.8%枸橼酸钠的注射器抽取血液。采样部位要充分消毒，避免外源污染的影响。采集抗凝血时，需轻微晃动血液，确保血液与抗凝剂充分混匀，防止因混合不均匀而导致血凝块的产生。

2）在养殖场或规模屠宰场自检时，常使用方便快捷的采集方式，即血拭子。通常采取耳血拭子或尾根血拭子，采集前对采集部位进行消毒，用一次性针头扎破尖或尾根浅表血管，用医用棉签蘸取适量血样，将白色棉签全部染成红色，每头猪1 个棉签，血拭子采集时，确保蘸取足够的血量，确保病毒的检出率。采样结束按压止血至血液不再渗出，严防污染其他猪只。

3）非洲猪瘟检测可使用棉拭子检测，棉拭子采集时，眼鼻、肛门棉拭子确保采集到分泌物，否则为无效样品，无法检出病毒或为低检出。

4）病死猪或屠宰场宰后胴体抽检时，采集病死猪组织样品，主要采集下颌淋巴结和脾脏组织。采样时防止肠道等内容物污染，取样时采集病猪病变的组织，胴体采集时，采集组织病变部位的中部，确保样品采集量适中。采样后放入样品保存管或保存袋中，标记后密封保存。

1.2 样品的保存与运输

1）血液样品的保存与运输。抗凝血样品采集后，在抗凝剂与血液充分混匀的前提下，冷藏保存，防止暴晒。蘸取浅表血之后，将血拭子放入含有适量PBS 或生理盐水的无菌试管中，冷藏保存；血样采集管需正向静置后，在采集样品12h 内送至实验室检测，样品若置于常温或超出12h 后进行检测，则会降低病毒含量，影响检测结果。

2）棉拭子保存与运输。棉拭子采集后，放入含有适量PBS 或生理盐水的无菌试管中，严禁常温干燥放置采集的棉拭子，或将棉拭子放置于不卫生的容器中，导致棉拭子污染或干燥。采样后12h 内送至实验室检测或冷冻保存待检。

3）组织样品保存与运输。采集组织样品后，对样品进行分类放置，严格放置于组织保存管或密封袋内，冷藏保存，于采样后2～6h内冷藏送至实验室检测或冷冻保存待检。

2 实验环境及仪器设备耗材因素

2.1 实验环境

病毒检测实验室为相对独立的区域，病毒实验室建有屏障或缓冲区，确保实现相对封闭的环境。根据PCR 检测的要求，实验室内环境确保通风良好，湿度60%～70%之间，温度24～26℃，配备空调，减少温湿度对实验结果的影响。实验室要进行严格区域划分，确保各功能区有效分离。结合实验室布局，可根据操作先后顺序，大致分隔为实验准备、核酸提取、扩增分析3 个区域，确保净污分离，实验物品遵循单向流动，每次实验后使用过的仪器设备要及时进行消毒，且无害化处理废弃物，防止气溶胶的产生。

分区后注明各工作区域的名称，在对应区域中合理放置所需的仪器耗材，物资配备齐全。若分区不合理，则会导致样品处置过程产生交叉污染，从而影响实验的准确性。定期对实验室使用的仪器设备取样检测，若为阳性，需进行彻底消毒，并间隔一个潜伏期后复检为阴性方可继续使用。

2.2 仪器设备耗材

非洲猪瘟病毒检测实验室必须配备检测灵敏度相对较高且与检测相适应的仪器设备，各分区物资配备合理，如实验准备区应摆放冰箱、水浴锅、组织研磨仪、水槽、通风橱等。核酸提取区应配置生物安全柜、核酸提取仪、高速冷冻离心机、混均器、微量加样器等。扩增分析区配置荧光PCR 仪、电脑、打印机等。此外，各区域还应有带盖密封垃圾桶、消毒设备、工作服及一次性手套、口罩、吸头、离心管等耗材，各区域的设备物品不得交叉使用，各类仪器技术规程要达到检验项目的要求，重要仪器要制定仪器操作规程及使用维护记录等，严格按照操作规程进行使用维护，保证其在规定参数内正常运行。各类耗材确保在保质期使用，保存方法得当，避免耗材污染。吸头、离心管等使用前进行灭菌或者为无酶无菌耗材，各类仪器使用后进行清洗消毒。

3 实验试剂

3.1 试剂的选择与保存

为了快速完成非洲猪瘟病毒检测，目前基层开展非洲猪瘟病毒检测时主要采用成品试剂盒，包括核酸提取试剂盒和非洲猪瘟核酸扩增试剂盒两种。在购买试剂盒时，应选择具有非洲猪瘟病毒检测生产经营试剂盒使用资质的厂家，已取得农村农业部核发的产品批准文号的非洲猪瘟病毒诊断制品，并通过正规途径购买。为确保检测结果准确可信，尽量使用与各级实验室相同的诊断试剂，从而减少与上级部门检测试剂差异因素。

检测试剂需严格按试剂盒要求保存的温度条件进行保存，错误的保存温度会严重影响试剂的检测灵敏度甚至完全失效，导致实验耗时及资金投入增加。通常核酸提取试剂盒存放于干燥室温环境，扩增试剂盒存放于-20℃。扩增试剂盒购入时对扩增检测试剂进行部分按需分装，减少试剂反复冻融而影响试剂的检测效果。

3.2 试剂的使用

目前常用非洲猪瘟病毒扩增试剂盒主要为两种，一种是根据PCR 反应体系所需试剂，在计算用量后，结合使用量分别加入后混合使用的，主要包含水、PCR 反应液、引物探针混合液。一种是配合好的A、B 液，两种混合液全部混合均匀即可。混合时要进行充分混合，使用微量移液器时要规范操作，确保各试剂使用量足够。冷冻试剂使用时要提前进行回温，确保试剂完全融化。PCR 反应体系中酶对温度敏感，使用时应置于冰上操作，用完后及时冷冻保存，按需分装，减少冻融次数。确保试剂在有效期内使用，做好试剂登记管理。

核酸提取试剂盒分为手动提取和机提试剂盒两种，手动提取试剂盒操作步骤繁琐，耗时相对较长，人工操作容易造成核酸提取量不足或核酸受污染等人为因素较大，在基层非洲猪瘟病毒核酸提取时应用较少。手动提取试剂盒操作时严格按照操作步骤进行，试剂反应时间及离心速度、试剂加入用量充足等，做好标记，规范操作，避免交叉污染，否则均会影响核酸的浓度和纯度。机提试剂盒使用时确保样品加入至提取液面以下，蛋白酶k 的用量充足，并做好标记，避免加错反应孔。吸头不可重复使用，防止交叉污染。机提试剂盒需与核酸提取仪匹配，方能有效提取核酸。

4 人员因素

4.1 检测人员的配置

非洲猪瘟病毒荧光定量PCR 检测对实验室操作的要求更为严格，它是以DNA 扩增检测分子生物学的检测技术，要求取得检测资质的兽医实验室应配备2 名以上具有实验室检测技术且掌握简单英语的人员，以确保实验的可重复性。检测人员应经过标准化、系统化的实验室技术规范、相关法律法规、操作规程、生物安全防护知识和实际操作技能等培训，并获得检测资格后方可开展相关检测工作。

4.2 检测人员技术要求

进行非洲猪瘟病毒检测的人员，不仅要具备强烈的责任心，耐心细致的进行实验操作，具有严谨对待科学实验的态度，还需熟知实验原理，熟练操作相关设备，规范使用仪器，熟悉检测步骤和方法，明确工作流程，掌握实验质量控制方法、检测结果分析及生物安全防护措施。在出现错误时具有分析查找原因的能力。在实验操作过程中，严格按照实验程序，高度集中精神，防止加错样品或跳孔现象的发生，正确使用移液器，使用前检查移液器量程，吸取液体时观察吸头液体的吸取量和是否取到液体。实验室人员要参与相关部门的盲样比对考核，合格后方可上岗。定期进行实验室技能培训，查缺补漏，提高实验室各项技能，确保科学规范的检测流程，准确可靠的检测数据。

5 讨论

经过以上分析，非洲猪瘟病毒检测从采样至实验室检测操作中的每一个环节，都会不同程度的对其检测结果的准确性产生影响。因此，在检测失败时，认真分析查找影响因素对非洲猪瘟病毒检测的准确性起到关键性作用。在基层实践操作中，需要工作人员认真严谨的对待操作中的各个环节，不断积累和总结经验、查找问题等能力也是提高非洲猪瘟病毒检测准确性的必备技能还需配备与检测要求相符合的实验条件，尽可能的认识和排除影响实验结果的风险因素。合进而逐一避免，使非洲猪瘟检测及时发挥预警预报作用，从而指导非洲猪瘟防控工作。