DC-CIK诱导宫颈癌细胞休眠的实验研究

赵 晴，刘 艳，邓渊润

宫颈癌为临床最常见的女性上皮性恶性肿瘤，多形成于宫颈上皮组织瘤变[1-2]。宫颈癌具有发病率高、治疗难度大、病死率高等特点，据不完全统计，宫颈癌发病率、病死率均为妇科恶性肿瘤首位，多发于中年患者[3-4]。放化疗、外科手术等均为宫颈癌的常用治疗手段，但因个体差异，治疗效果差异较大。树突状细胞(dendritic cell, DC)-杀伤细胞(killer cell, CIK)生物细胞免疫疗法在恶性肿瘤临床治疗中应用较为广泛，可促进免疫细胞的恢复[5]。张春利 等[6]研究表明，DC-CIK生物细胞可对宫颈癌细胞具有较高的杀伤效应，但为对其具体作用机制进行分析。该研究建立DC-CIK共培养体系对宫颈癌细胞进行干预，旨在探究DC-CIK细胞诱导宫颈癌细胞休眠的作用及相关作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞系及主要试剂宫颈癌SiHa细胞购自中国医学科学院。小鼠抗兔磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)抗体(美国Hyclone公司)；大鼠抗小鼠蛋白激酶B(protein kinase B, AKT)抗体(中国Selleck公司)；大鼠抗兔哺乳动物西罗莫司靶蛋白(mammalian target protein of sirolimus, mTOR)抗体(美国Invitrogen公司)；小鼠抗大鼠上皮性钙黏附素(epithelial calcium adhesins, E-cadherin)抗体(美国BD公司)；大鼠抗小鼠MMP-9抗体(德国Sigma公司)；PCR试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司；货号KG204]，matrigel基底膜胶(上海善然生物科技有限公司；货号356234)，四唑盐(MTT)试剂盒(北京百奥莱博科技有限公司提供；货号GL0510-OYT)；Transwell板(上海伟进生物科技有限公司；货号3422)。

1.2 宫颈癌SiHa细胞培养对冻存宫颈癌SiHa细胞进行火浴处理，之后置于含10%胎牛血清培养基，3 000 r/min离心后重悬、传代，将培养基置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。

1.3 DC细胞、CIK细胞培养选取2020年3月-2021年3月于南方医科大学第三附属医院就诊的、未进行过相关治疗的宫颈癌患者10例，Ⅲ期6例，Ⅳ期4例，共抽取患者清晨空腹静脉血60 ml，添加200 μl肝素钠。取患者淋巴细胞分离液50 ml，以每管5 ml分于10支离心管，均添加静脉血6 ml，之后2 500 r/min离心15 min。取2个消毒后的50 ml离心管，取离心后上层血清置于一管内，取离心后中层细胞置于另一管中，并添加生理盐水将管中液体补至50 ml，细胞计数后5 000 r/min离心10 min。提取5×107个细胞用于DC细胞培养，其余细胞用于CIK细胞培养，此时记为第1天。添加20%自体血清、腺嘌呤核苷三磷酸及1 000 μg/ml IFN-γ，次日添加100 μg/ml IL-1α、300 μg/ml IL-2、50 ng/ml CD3单克隆抗体，观察细胞数量，相应补加培养基扩增，第8天与DC细胞共培养。DC细胞接种至6孔板(密度5×107个/ml)，2 ml/孔，此时记为第1天，添加500 μg/ml IL-4、1 000 μg/ml GM-CSF，第4天补加2 ml DC培养液，第6天添加抗原，第7天添加500 μg/ml TNF-α。第8天使用巴氏管收集DC细胞(铺板密度1×107个/ml)及CIK细胞(1×109个/ml)混合共培养，根据混合后细胞数量补加培养基扩增，第10天对培养的DC-CIK进行微生物检测，第14天用于实验。

1.4 细胞培养及分组取生长状态较好的对数生长期SiHa细胞进行胰酶消化，并接种于96孔板，浓度为每孔5×104个，将96孔板置于细胞培养箱(37 ℃、5% CO2)内过夜培养。分别将100 μl培养基、培养5 d的DC细胞、培养7 d的CIK细胞及联合培养3 d的CIK-DC细胞每孔均为1×105个接种于96孔板(铺有靶细胞)，分别为宫颈癌组、DC组、CIK组、DC-CIK组。各组细胞均于细胞培养箱培养1 d，CCK-8试剂加至孔内(20 μl/孔)，再次培养2 h，观察各组细胞存活率。

1.5 细胞生物学行为检测

1.5.1MTT比色法检测细胞增殖能力变化 使用0.125%胰蛋白酶消化细胞，制备单细胞悬液并接种于96孔板，每组3个复孔，2×103个/孔，将96孔板置于37 ℃、5% CO2培养箱中，分别于培养24、48、72 h加入20 μl MTT，计算细胞增殖率。

1.5.2TUNEL法检测细胞凋亡 4组细胞均添加蛋白酶K 20 μg/ml进行培养，1.5 h后去除蛋白并添加平衡缓冲液100 μl及TdT酶反应液，置于遮光环境中培养1 h后添加100 μl SSC溶液，静置30 min后取出清洗，DAPI复染后遮光培养10 min，清洗、封片观察。

1.5.3Transwell小室实验检测细胞侵袭能力 小室湿化后添加细胞悬液200 μl，下室内添加细胞培养液(含10%胎牛血清)，使用细胞培养箱室内培养1 d，第2天取出后使用PBS液清洗，之后使用4%多聚甲醛进行染色，静置30 min后使用显微镜观察。

1.5.4划痕实验检测细胞迁移能力 使用胰蛋白酶消化处理细胞，细胞悬液接种于6孔板，使用10 μl移液器枪头垂直于孔板底部画直线，使用PBS缓冲液清洗后室内培养1 d，拍照计算划痕。

1.6 Western blot法检测细胞凋亡、侵袭蛋白表达4组细胞分别取50 μg蛋白，煮沸，蛋白变性后进行SDS-PAGE凝胶电泳并转膜，使用Western封闭液室内封闭3 h，之后加入TBST稀释的羊抗鼠PI3K、Akt、mTOR、E-cadherin、MMP-9(1 ∶2 500)一抗，并于5 ℃环境孵育1 d，取出后使用PBS清洗，之后添加二抗(1 ∶5 000)孵育1 h，取出清洗后进行显色、曝光、成像，以β-actin为内参，检测条带灰度值，计算PI3K、Akt、mTOR、E-cadherin、MMP-9相对表达量。

2 结果

2.1 各组细胞增殖、凋亡能力变化如表1所示，24、48、72 h时，宫颈癌组、DC组细胞增殖率、凋亡率比较，差异无统计学意义(P>0.05)；与宫颈癌组、DC组比较，CIK组、DC-CIK组细胞增殖率较低，凋亡率较高，差异有统计学意义(P<0.05)；与CIK组比较，DC-CIK组细胞增殖率较低，凋亡率较高，差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 各组细胞增殖、凋亡能力变化

2.2 各组细胞存活率比较如图1所示，与宫颈癌组、DC组比较，CIK组、DC-CIK组细胞存活率较低，且DC-CIK组细胞存活率低于CIK组，差异有统计学意义(P<0.05)。

图1 各组细胞存活率比较与宫颈癌组比较：*P<0.05；与DC组比较：#P<0.05；与CIK组比较：△P<0.05

2.3 各组细胞侵袭、迁移能力比较如表2、图2所示，宫颈癌组、DC组细胞侵袭、迁移细胞数比较，差异无统计学意义(P>0.05)；与宫颈癌组、DC组细胞比较，CIK组、DC-CIK组细胞侵袭、迁移细胞数较低，差异有统计学意义(P<0.05)；与CIK组细胞比较，DC-CIK组细胞侵袭、迁移细胞数较低，差异有统计学意义(P<0.05)。

表2 各组细胞侵袭、迁移能力比较(个，

图2 各组细胞侵袭情况 结晶紫染色 ×100A：宫颈癌组；B：DC组；C：CIK组；D：DC-CIK组

2.4 各组细胞凋亡蛋白相对表达量比较如表3、图3所示，宫颈癌组、DC组PI3K、Akt、mTOR相对表达量比较，差异无统计学意义(P>0.05)；与宫颈癌组、DC组比较，CIK组、DC-CIK组细胞PI3K、Akt、mTOR相对表达量较低，差异有统计学意义(P<0.05)；与CIK组比较，DC-CIK组细胞PI3K、Akt、mTOR相对表达量较低，差异有统计学意义(P<0.05)。

表3 各组细胞凋亡蛋白相对表达量比较

图3 Western blot法检测PI3K、Akt、mTOR表达A：宫颈癌组；B：DC组；C：CIK组；D：DC-CIK组

2.5 各组细胞侵袭相关蛋白相对表达量比较如表4、图4所示，宫颈癌组、DC组细胞E-cadherin、MMP-9相对表达量比较，差异无统计学意义(P>0.05)；与宫颈癌组、DC组比较，CIK组、DC-CIK组细胞E-cadherin相对表达量较高，MMP-9相对表达量较低，差异有统计学意义(P<0.05)；与CIK组比较，DC-CIK组细胞E-cadherin相对表达量较高，MMP-9相对表达量较低，差异有统计学意义(P<0.05)。

表4 各组细胞侵袭相关蛋白相对表达量比较

图4 Western blot法检测E-cadherin、MMP-9表达A：宫颈癌组；B：DC组；C：CIK组；D：DC-CIK组

3 讨论

有研究[7]显示，宫颈癌发病早期临床特征并不明显，随着疾病的进展患者可能出现阴道流血、下肢水肿、心慌气短、皮炎、尿急、阴道排液等情况，进而对生存质量、日常生活造成了影响。HPV感染、不良孕产史、性行为等均为宫颈癌发病主要危险因素，但目前宫颈癌发病机制尚不清楚[8]。大量临床研究[9]显示，DC-CIK细胞在肝癌、肺癌等多种恶性肿瘤治疗过程中具有较为理想的临床疗效，DC-CIK细胞可通过分泌IL-12等细胞因子激活初始T细胞，进而对适应性免疫应答起到了诱导作用，最终发挥了抗肿瘤的作用。

细胞实验研究[10]显示，恶性肿瘤的发展演进与恶性肿瘤细胞的增殖能力、凋亡能力具有密切联系。有学者研究表明，对宫颈癌细胞增殖、凋亡、周期分布等生物学行为进行调控，能够抑制癌细胞不断发展扩散，这也是临床治疗宫颈癌的关键[11]。本研究显示，建立DC-CIK共培养体系后对宫颈癌细胞进行干预，宫颈癌细胞增殖率下降、凋亡率上升，并且随着细胞培养时间的推移，使用DC-CIK细胞干预的宫颈癌细胞增殖率逐渐下降，凋亡率逐渐上升，细胞存活率较低，其原因为，建立DC-CIK共培养体系干预，DC-CIK细胞兼具DC细胞提呈抗原及CIK细胞杀灭癌细胞的作用，因而能够起到抑制宫颈癌细胞增殖、促进凋亡、抑制癌细胞存活率的作用。

研究[12]表明，PI3K/Akt/mTOR通路在细胞生物学行为变化过程中能够发挥重要作用。PI3K、Akt、mTOR均为PI3K/Akt/mTOR通路相关蛋白，大量实验研究[13]结果显示，抑制PI3K/Akt/mTOR通路相关蛋白PI3K、Akt、mTOR表达，能够抑制癌细胞增殖、促进癌细胞凋亡，对恶性肿瘤的治疗和患者预后改善具有重要意义。本研究显示，建立DC-CIK共培养体系后对宫颈癌细胞进行干预，宫颈癌细胞PI3K、Akt、mTOR表达大幅下调，说明使用DC-CIK细胞干预可能通过调控PI3K/Akt/mTOR通路表达，起到干预宫颈癌细胞增殖、凋亡的作用，由此推测，DC-CIK干预对宫颈癌细胞增殖起到抑制作用的机制可能是调控PI3K/Akt/mTOR通路蛋白表达。

大量研究[14]表明，癌组织的不断发展扩散与癌细胞侵袭迁移能力有密切联系。有研究[15]显示，抑制宫颈癌细胞侵袭、迁移能力对宫颈癌细胞的发展扩散具有抑制作用。有研究[16]表明，E-cadherin、MMP-9表达变化与细胞侵袭、迁移能力密切相关。本研究显示，建立DC-CIK共培养体系后对宫颈癌细胞进行干预，宫颈癌细胞侵袭、迁移数下降，且E-cadherin表达大幅上调，MMP-9表达大幅下调，说明使用DC-CIK细胞干预能够抑制宫颈癌细胞侵袭、迁移能力，其分子机制可能是因为使用DC-CIK细胞干预能够调控细胞侵袭相关蛋白E-cadherin、MMP-9表达。

综上所述，建立DC-CIK共培养体系，并对宫颈癌细胞进行干预，能够抑制宫颈癌细胞增殖、侵袭、迁移，促进宫颈癌细胞凋亡，从而起到诱导宫颈癌细胞休眠的作用，其机制可能是使用DC-CIK细胞培养可能调控PI3K/Akt/mTOR通路蛋白及侵袭相关蛋白表达，由此推测，DC-CIK生物细胞免疫疗法可能对宫颈癌细胞增殖具有一定的抑制作用，为宫颈癌的临床治疗研究提供新的方向。