阿尔茨海默病患者血清中Apelin13和FKBP5的表达水平及临床意义

闫春晓，李培越，郑启秘，邹晓，李建波

阿尔茨海默病（Alzheimer′s disease，AD）是一种以进行性记忆受损、认知功能障碍为主要表现的神经系统退行性病变，其发病率和发病人数在近几年增长迅速，已成为全球性公共卫生问题［1］。AD初期表现缺乏特异性，易被忽视，确诊时多数患者已出现认知功能障碍等问题，通常无法进行有效治疗。因此，预防AD患者发生重度认知功能障碍的关键措施是寻找到早期诊断标志物。Apelin13属于血管活性肽，由77个氨基酸残基组成，其编码基因位于染色体Xq25，在视网膜、心脏及大脑等组织中均有表达，参与调节应激反应、血管生成、能量代谢及内环境稳态等生理过程［2］。研究显示，Apelin13能够抑制星形胶质细胞的异常活化，促进血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）生成，维持神经元活性，诱导微血管生成，缓解脑组织因缺血、缺氧所致的损伤［2］。FK506结合蛋白51（FK506 binding protein 51，FKBP5）属于亲免素蛋白家族，编码基因定位于染色体6p21，通过结合特定的分子伴侣蛋白，调节类固醇激素受体活化、细胞核移位及蛋白质折叠等生物学过程［3］。研究表明，FKBP5蛋白的FK506结合结构域具有异构酶活性，能够促进激素-受体复合物形成，介导应激反应，诱导抑郁症的发生［3］。目前，Apelin13和FKBP5mRNA在AD中表达的相关研究少见，且两者与认知功能障碍的关系尚不清楚。本研究就此进行探讨。

1 对象与方法

1.1研究对象选取2018年10月—2021年10月达州市中心医院收治的AD患者（AD组）93例，符合《中国痴呆诊疗指南（2012版）》中的诊断标准；男43例，女50例；年龄55～72岁，平均（64.33±9.02）岁；受教育程度：小学32例，初中44例，高中及以上17例；伴有糖尿病者45例，伴有高血压者52例。纳入标准：精神状态稳定，具有独立完成相关量表评分的能力。排除标准：（1）由乙醇、感染、药物、营养障碍及外伤所致的其他类型痴呆。（2）合并其他影响认知功能的脑部疾病，如癫痫、帕金森病及脑炎等。（3）存在自残倾向者。（4）伴有先天性神经系统发育异常者。（5）伴有重度视听障碍，无法完成量表评分者。（6）合并恶性肿瘤，如胶质瘤、肺癌、肝癌及前列腺癌。（7）心、肝、肾功能障碍者。（8）合并全身严重感染者。选取同期同年龄层来院体检的健康者（对照组）90例，男46例，女44例；年龄56～71岁，平均（65.58±9.39）岁；受教育程度：小学28例、初中40例、高中及以上22例；伴有糖尿病者37例，伴有高血压者41例。2组年龄（t=0.919）、性别（χ2=0.436）、受教育程度（χ2=1.050）、糖尿病史（χ2=0.980）及高血压史（χ2=1.954）比较差异无统计学意义（均P＞0.05），具有可比性。本研究经本院伦理委员会批准（伦理号：M201803-074），全部研究对象均签署知情同意书。

1.2主要仪器与试剂离心机购自美国Labnet公司（型号：SCI-12）。全自动生化分析仪购自瑞士罗氏公司（型号：COBAS INTEGRA 800）。DynabeadsTMmRNA Purification Kit试剂盒购自上海研卉生物科技有限公司（批号：20180926）。iScript cDNA Synthesis Kit购自Bio-Rad公 司（批 号：20180915）。SunShineBioTM实时荧光定量PCR（Real-time Quantitative PCR Detecting，qPCR）检测系统Master Mix kit购自南京生兴生物技术有限公司（批号：20180921）。

1.3血清指标测定研究对象均于空腹状态下采集肘正中静脉血10 mL置于抗凝管中，离心机（4℃，离心半径10 cm）6 000 r/min离心5 min，收集上清液，置于-80℃冰箱中保存。采用全自动生化分析仪检测血清中Apelin13、总胆固醇（total cholesterol，TC）、低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein，LDL-C）水平。

1.4qPCR法检测血清FKBP5mRNA表达水平采用DynabeadsTMmRNA Purification Kit提取AD患者血清中的总RNA。将提取的总RNA滴入20 μL无RNA酶的水中溶解，通过紫外分光光度仪计算RNA的纯度和浓度。利用iScript cDNA Synthesis Kit将总RNA逆转录为cDNA。反应条件：42℃60 min，85℃15 min。通过SunShineBioTMqPCR Master Mix kit定量检测FKBP5mRNA的表达水平。PCR扩增体系（20 μL）：Taq PCR MasterMix 10 μL，cDNA样本3 μL，dH2O 5 μL，上下游引物各1 μL。FKBP5引物：上游5′-TTTGACTGCAGAGATGTGGC-3′，下 游5′-CCTGCCTCTCCAAAACCATA-3′。GAPDH引物：上 游5′-GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-3′，下游5′-ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA-3′。引物序列由苏州泓迅生物科技公司合成。PCR反应条件：预变性95℃20 s；变性95℃20 s，退火60℃30 s，延伸70℃5 s，扩增40个循环。每个样本设置3个复孔。以2-ΔΔCt法计算FKBP5mRNA的表达水平，其中ΔCt=Ct目的基因-Ct内参基因。

1.5认知功能障碍评估采用简易精神状态量表（minimental state examination，MMSE）［4］评估AD患者的认知功能障碍，主要从瞬时记忆、短时记忆、视觉及空间感觉、定向力、注意力计算力及语言表达能力进行评分。总分30分，其中正常为25～30分，轻度为20～24分、中度为10～19分、重度为＜10分。

1.6统计学方法采用SPSS 22.0和Medcalc 15.2软件进行数据分析。符合正态分布的计量资料以±s表示，2组间比较采用2独立样本t检验；多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较用Bonferroni法。计数资料以例（%）表示，组间比较采用χ2检验。Pearson相关分析Apelin13、FKBP5mRNA与MMSE评分的相关性。采用受试者工作特征（ROC）曲线分析Apelin13、FKBP5mRNA对AD患者发生重度认知功能障碍的诊断价值。采用二元Logistic回归构建Apelin13、FKBP5mRNA联合诊断模型，得到两者联合应用的预测概率值，将生成的预测概率值作为新的诊断指标进行ROC曲线分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对照组和AD组血清学指标、FKBP5mRNA及MMSE评分比较2组血清LDL-C、TC差异无统计学意义；与对照组比较，AD组MMSE评分和血清中Apelin13水平降低，而血清中FKBP5mRNA水平升高（均P＜0.01），见表1。

Tab.1 Comparison of serum indicators,FKBP5 mRNA and MMSE score between the two groups表1 2组血清学指标、FKBP5 mRNA及MMSE评分比较（±s）

Tab.1 Comparison of serum indicators,FKBP5 mRNA and MMSE score between the two groups表1 2组血清学指标、FKBP5 mRNA及MMSE评分比较（±s）

＊＊P＜0.01。

组别对照组AD组t n 90 93 LDL-C（mmol/L）2.03±0.59 2.18±0.63 1.661 TC（mmol/L）3.78±1.06 4.04±1.17 1.574 Apelin13（μg/L）43.69±10.06 17.82±5.07 21.857＊＊FKBP5 mRNA 1.13±0.32 3.88±1.11 22.928＊＊MMSE评分（分）28.29±1.68 15.21±4.61 25.336＊＊

2.2 二元Logistic回归模型分析AD的影响因素以是否发生AD为因变量（否=0，是=1），以MMSE评分、FKBP5mRNA及Apelin13为自变量，二元Logistic回归分析显示，较高的MMSE评分、Apelin13是AD发生的保护因素，而较高的FKBP5mRNA是AD发生的危险因素（均P＜0.05），见表2。

Tab.2 Binary Logistic regression model analysis of influencing factors of AD表2 AD影响因素的二元Logistic回归模型分析结果

2.3 不同程度认知功能障碍AD患者血清中Apelin13和FKBP5mRNA的比较轻、中及重度组认知功能障碍AD患者血清中Apelin13水平依次降低，而FKBP5mRNA水平依次升高（均P＜0.05），见表3。

Tab.3 Comparison of Apelin13 and FKBP5 mRNA between AD patients with different levels of cognitive impairment表3不同程度认知功能障碍AD患者血清中Apelin13和FKBP5 mRNA的比较 （±s）

Tab.3 Comparison of Apelin13 and FKBP5 mRNA between AD patients with different levels of cognitive impairment表3不同程度认知功能障碍AD患者血清中Apelin13和FKBP5 mRNA的比较 （±s）

类型轻度组中度组重度组F n 10 51 32 Apelin13（μg/L）25.62±6.91 18.92±5.03a 13.63±3.27ab 27.359＊＊FKBP5 mRNA 3.09±0.72 3.72±0.91a 4.38±0.96ab 9.373＊＊

＊＊P＜0.01；a与轻度组比较，b与中度组比较，P＜0.05。

2.4 AD患者血清中的Apelin13、FKBP5mRNA水平与MMSE评分的相关性AD患者MMSE评分与血清FKBP5mRNA水平呈负相关，而与Apelin13水平呈正相关（r分别为-0.706、0.722，均P＜0.05）。

2.5 血清Apelin13、FKBP5mRNA水平对AD患者重度认知功能障碍的诊断价值以AD患者是否发生重度认知功能障碍为因变量，以Apelin13和FKBP5mRNA为自变量，进行两者联合诊断的二元Logistic回 归 方 程 为logit（Y）=-3.623+0.358×（Apelin13）+2.137×（FKBP5mRNA）。结果显示，相较于单一Apelin13或FKBP5mRNA指标，Apelin13联合FKBP5mRNA诊断重度认知功能障碍的曲线下面积（AUC）、敏感度和特异度均较高，见图1、表4。

Fig.1 Diagnostic values of serum Apelin13 and FKBP5 mRNA levels for severe cognitive impairment in AD patients图1血清Apelin13、FKBP5 mRNA水平对AD患者重度认知功能障碍的诊断价值

Tab.4 Diagnostic values of Apelin13 and FKBP5 mRNA for severe cognitive impairment表4 Apelin13、FKBP5 mRNA对重度认知功能障碍的诊断价值

3 讨论

AD是一种最常见的痴呆症，约占痴呆患者总数的80%，2019年世界新增AD患者约3 600万例［1］。AD的病理机制主要包括大脑质量减低、体积缩小，脑回（以颞叶海马区为主）萎缩，脑沟加深、变宽，神经纤维缠结积聚等［5-6］。AD发病是多因素共同叠加所致，可能与血管病变、遗传易感性、不良饮食习惯、受教育程度较低及激素水平异常有关。目前，临床尚无有效手段治疗AD，因此早期诊断、早期预防是治疗AD的关键措施。

Apelin13是一种内源性神经肽，主要由脂肪细胞分泌，其血浆水平及活性在Apelin家族中均居首位，可通过结合内源性受体血管紧张素Ⅱ1型受体相关蛋白（putative receptor protein related to the angiotensin receptor AT1，APJ）参与调控垂体释放功能激素、进食行为及学习记忆等过程［7］。动物实验表明，在缺血再灌注大鼠模型中，Apelin13能够降低血浆炎性因子和细胞因子水平，减少神经功能缺损，缩小脑梗死体积［8］。Angelopouluo等［7］研究发现，对帕金森症模型大鼠注射外源性Apelin13，可减轻其认知功能障碍，加快大鼠脑组织中尼氏体合成速度。本研究结果显示，AD组患者血清中Apelin13水平较对照组降低，提示Apelin13可能参与AD的起病过程，考虑原因是AD患者Apelin13的编码基因APLN沉默，无法完成转录翻译过程，使Apelin13合成减少，血清中Apelin13水平降低［7］。本研究结果显示，随着认知功能障碍的加重，AD患者血清中Apelin13水平逐渐降低，提示Apelin13可能在AD进展过程中具有保护作用，其原因可能是Apelin13失活能够降低促凋亡蛋白（B-cell lymphoma-2，bcl2）/bcl2相关X蛋白（bcl2-Associated X protein，bax）比值，增强半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase）活性，促进受体寡聚和适配蛋白募集，诱导海马区神经元凋亡，加重了认知功能障碍［9］。此外，Apelin13活性降低可阻碍APJ信号通路传导，抑制下游蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）表达，促进白细胞介素（interleukin，IL）-1和IL-6合成，破坏脑功能区的神经前体细胞，并抑制神经元分化，使脑内神经功能受损［10］。

FKBP5是一种FK506结合蛋白，分子质量约为51 ku，存在于细胞核中，在前额皮质、杏仁核及海马体中广泛表达，通过调节下丘脑-垂体-肾上腺（hypothalamic-pituitary-adrenocortical，HPA）轴，在应激反应和代谢效应中发挥重要作用［11］。研究表明，FKBP5mRNA能够延长HPA轴负反馈的反应时间，导致皮质醇类激素对压力刺激的反应敏感度降低，提高精神分裂症的发生风险［12］。Willi等［11］发现，与野生型斑马鱼相比，注射FKBP5mRNA的转基因斑马鱼的脊髓初级运动神经元轴突修复和重建能力均降低，而在注射FKBP5mRNA拮抗剂后轴突修复能力显著上升。本研究结果表明，AD组患者血清中FKBP5mRNA水平较对照组升高，提示血清FKBP5mRNA水平的高低可能与AD发病有关。其机制可能是FKBP5基因的CpG位点发生去甲基化，诱导增强子活化并结合RNA聚合酶，加速转录翻译过程，促进FKBP5mRNA合成并释放入血，导致血清中FKBP5mRNA表达水平升高［12］。随着认知功能障碍的加重，AD患者血清中FKBP5mRNA水平逐渐升高，提示FKBP5mRNA可能对AD的进展具有调控作用。其原因可能是FKBP5mRNA通过激活热休克蛋白90（heat shock protein 90，HSP90），诱导海马、杏仁核等区域Tau蛋白过度磷酸化，促进钙蛋白酶合成，介导突触后Ca2+持续内流，使神经元持续异常兴奋，加速神经元凋亡，诱导认知功能障碍发生［13］。此外，FKBP5mRNA异常活化能够抑制糖皮质激素受体（glucocorticoid receptor，GR）表达，对HPA轴负反馈作用减弱，使HPA轴功能异常，导致海马内大量神经元再生减少和神经元退行性变，海马功能受损，认知功能明显下降［14］。

二元Logistic回归分析显示，较高的MMSE评分、Apelin13是AD发生的保护因素，而较高的FKBP5mRNA是AD发生的危险因素，提示MMSE评分、血清FKBP5mRNA、Apelin13水平可能成为筛查AD的潜在指标。另外，本研究结果显示，AD患者MMSE评分与血清FKBP5mRNA水平呈负相关，而与Apelin13水平呈正相关，亦进一步证实血清Apelin13、FKBP5mRNA水平与认知功能障碍具有相关性，2个指标在定量评估认知功能障碍严重程度方面具有潜在价值。其原因可能是Apelin13活性被抑制后使线粒体功能发生障碍，抑制了线粒体酶复合物合成，活性氧（reactive oxygen，ROS）和自由基产生增多，激活了糖原合成酶激酶3（GSK-3），诱导β-淀粉样蛋白（β-amyloid，Aβ）积聚，使大脑皮层内神经纤维丝缠结，导致神经认知和记忆功能受损［15］。FKBP5mRNA异常活化能够促进Tau蛋白磷酸化，使Tau蛋白活化，活化的Tau蛋白无法与神经纤维内的微管蛋白结合，导致微管结构解聚，轴突信号转运功能丧失，突触逐渐萎缩，神经元失活，加重了认知障碍程度［13-14］。此外，FKBP5mRNA能够抑制磷脂酰肌醇-3激酶（phosphatidylinositol-3 kinase，PI3K）/AKT信号通路，阻碍Apelin13合成，从而加剧Aβ蛋白积聚，诱导神经元变性，突触轴突受损，影响神经信号的转导，损伤认知功能［10，16］。ROC曲线显示，Apelin13联合FKBP5mRNA的AUC值明显高于单一Apelin13或FKBP5mRNA，提 示Apelin13联 合FKBP5mRNA能够提高对AD患者重度认知功能障碍的诊断价值，同时，较高的敏感度有利于早期筛查可能发生重度认知功能障碍的AD患者，为早期临床防治提供可靠支持。

综上所述，AD患者血清中Apelin13水平降低，而FKBP5mRNA水平升高。同时，血清中Apelin13、FKBP5mRNA水平能够反映AD患者的认知功能障碍严重程度。Apelin13联合FKBP5mRNA对AD患者重度认知功能障碍具有良好的诊断效能，且敏感度较高，有助于临床实施早期干预，但血清中Apelin13和FKBP5mRNA变化的具体机制尚不清楚，需要在基础实验中进一步证实。