基于生信分析筛选老年性聋关键基因及相关信号通路研究

胡赛南 韩贺舟 马秀岚

中国医科大学附属盛京医院耳鼻咽喉头颈外科（沈阳 110004）

老年性聋主要表现为与年龄相关的、双耳对称的、缓慢进行的感音神经性听力下降。老年性聋是老年人群中第三大最常见的慢性病，随着年龄的增加，人群听力损失程度增加明显。世界卫生组织称，65岁以上人群中约有三分之一患有听力损失[1]。老年性聋患者面对的不仅仅是听力阈值提高的问题，最新研究也发现老年性聋通常伴有言语识别能力下降，并容易加剧焦虑抑郁状态和阿尔兹海默症等认知缺陷的发生[2,3]。目前临床上并没有针对老年性聋的特效药物治疗，其主要治疗手段是人工听觉装置，包括助听器和人工耳蜗植入，高昂的治疗费用以及患者降低的生活质量给社会造成了巨大的经济负担。因此针对年龄相关性听力损失的研究一直是听力学的热点。

老年性聋是一种多因素作用的疾病，其潜在危险因素包括年龄、性别、种族、环境（如噪音暴露、耳毒性药物）、生活方式、慢性疾病合并症和遗传倾向[4]。老年性聋的病理改变多样且发病机制复杂。外周神经病变是老年性聋的主要发生机理之一，内耳中许多结构，尤其是毛细胞及螺旋神经节神经元，都对老化过程十分敏感[5]。除了外周病变外，中枢听觉通路的变化也会促进老年性聋的发展。目前，有关老年性聋分子水平机制的相关研究已经有了很大的进展，氧化应激及细胞凋亡、耳蜗毛细胞及突触病变、血管纹改变、螺旋神经节的变性、离子通道、激素和microRNA等都在其中发挥作用[6-9]。然而这些机制的遗传基础仍有很大的探索和研究空间。

近年来，基因芯片和高通量测序技术迅猛发展，越来越多的人类和动物遗传学研究都涉及到鉴别治疗老年性聋的潜在基因靶点。目前已经有一些研究关注于在老年性聋发生发展过程中可能发挥一定作用的基因和蛋白，但是有显著诊治意义的靶点仍未明确。本研究将通过GEO平台，应用生物信息学方法，分析老年性聋关键基因及相关信号通路，旨在为老年性聋的发病机制和诊治提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

从GEO数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下载编号为GSE6045的基因芯片原始数据。GSE6045数据集来自于GPL339平台的[MOE430A]Affymetrix Mouse Expression 430A基因芯片，共有6例样本，其中包含3例7周龄DBA/2J小鼠耳蜗组织(GSM140222，GSM140223，GSM140224)及3例36周龄DBA/2J小鼠耳蜗组织(GSM140225，GSM140226，GSM140227)。听觉脑干反应检测证实，36周龄小鼠出现重度的年龄相关性听力损失，而7周龄小鼠出现中度听力损失。

1.2 方法

1.2.1 数据处理与差异表达基因筛选

本研究根据GSE6045数据中的样本周龄分为group1(7周龄）和group2(36周龄），将样本数据归一化处理后，通过在线工具GEO2R对GSE6045中的基因表达数据进行分析，筛选差异表达基因（Differentially Expressed Genes，DEGs）。差异表达基因筛选标准为：P.adj（P.adjust，校正后P值）＜0.05，且｜log2FC｜＞1（Fold Change，差异倍数）。使用R软件绘制基因热图和火山图，火山图以log2FC为横坐标，以-log10（P.adj）为纵坐标。

1.2.2 GO及KEGG分析

使用 DAVID v6.8（The Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery）在线分析工具对已筛选出的差异表达基因进行GO功能及KEGG通路富集分析。GO功能富集分析包含3部分内容，分别为生物学过程（Biological Process，BP）、细胞成分（Cellular Component，CC）和分子功能（Molecular Function，MC）。以P＜0.05作为标准筛选出具有显著差异富集的结果，通过R软件进行可视化（ggplot2包 [3.3.3版本]）。

1.2.3 PPI网络构建及功能模块分析

STRING 数据库（https://www.string-db.org/）是一个集合了已知的和可预测的蛋白质-蛋白质相互作用的数据库，目前涵盖了来自5 090个生物体的24 584 628个蛋白。将筛选出的差异表达基因通过STRING 11.0数据库构建老年性聋小鼠耳蜗组织中差异表达基因的PPI网络，筛选条件为互作评分＞0.4。使用Cytoscape软件（http://www.cytoscape.org/）将STRING数据库分析得到的PPI网络进行可视化分析。使用Cytoscape中的MCODE插件筛选功能模块，以MCODE评分＞10为筛选条件。

1.2.4 关键基因的筛选及验证

利用Cytoscape中的cytoHubba插件筛选关键基因（hub gene）。分别采用7种算法进行筛选，包括 Degree、Closeness、BottleNeck、Radiality、Betweenness、Stress、MNC算法。再进行综合分析，得到在各算法中均排在前10位的关键基因。

2 结果

2.1 差异表达基因筛选

本研究的生物信息学分析过程见图1。将GSE6045的数据进行归一化处理，结果见图2。本研究选用的研究数据具有代表性，可以为后续分析结果提供良好的客观性基础。通过GEO2R分析后，共筛选出1000个符合P.adj＜0.05，且｜log2FC｜＞1条件的差异表达基因，其中540个基因表达上调，460个基因表达下调。图3a显示了GSE6045的差异表达基因的火山图。根据｜log2FC｜，将前20个上调的基因和前20个下调的基因定位在热图上，如图3b所示。

图1 流程图Fig.1 workflow

图2 数据归一化Fig.2 Data normalization

图3 a.火山图 b.热图Fig.3 a.Vocanol map b.Heat map

2.2 GO及KEGG分析

GO功能富集分析结果表明，GSE6045的差异表达基因在免疫系统过程、中性粒细胞趋化、肌肉收缩、炎性反应、衰老等生物学过程中显著富集。这些差异表达基因主要定位于细胞外区域、细胞外外泌体等。差异表达基因主要参与调控肌动蛋白结合、蛋白质结合、钙离子结合等分子功能。

KEGG通路富集分析结果显示，差异表达基因主要富集于白细胞跨内皮迁移、蛋白质消化和吸收、细胞外基质-受体相互作用、Rap1信号通路、粘着斑等信号通路。如图4所示。

图4 GO及KEGG富集分析BP：生物学过程CC：细胞成分MF：分子功能KEGG:京都基因与基因组百科全书数据库Fig.4 GO and KEGG enrichment analysisBP：biological processCC：cellular componentMF：molecular functionKEGG:Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes

2.3 PPI网络构建及功能模块分析

将从7周龄和36周龄小鼠耳蜗组织间筛选得到的1000个差异表达基因导入STRING数据库构建PPI网络，预测差异表达基因编码的蛋白质之间的相互作用。下载结果并使用Cytoscape软件进行可视化呈现，PPI网络共有928个节点和6360条相互作用线。利用Cytoscape中的MCODE插件，筛选出核心的功能模块，筛选条件为MCODE评分＞10，得到3个功能模块，如图5所示。

图5 PPI网络中的3个功能模块a.MCODE score=22.041b.MCODE score=12.848c.MCODE score=12.783红色：基因表达上调 蓝色：基因表达下调Fig.5 Three functional modules in PPI network

a.MCODE score=22.041 b.MCODE score=12.848 c.MCODE score=12.783

Red:gene expression is up-regulated Blue:gene expression is down-regulated

2.4 关键基因筛选

基于Cytoscape软件中的cytoHubba插件，分别利用7种算法各自筛选出PPI网络中的10个关键基因，进而综合筛选出共有的关键基因，包括PTPRC、MMP9和IGF1，结果如表1所示。

3 讨论

据统计，到2025年，全球60岁以上人口将达到12亿，其中超过5亿人将患有严重的老年性聋[1]。老年性聋起病隐匿且发展缓慢，很难能够做到早发现、早诊断、早治疗。而且，随着疾病的进行性发展，老年性聋患者还可能出现一系列精神心理问题，为世界人口健康和经济发展带来了巨大的负担[10]。

老年性聋一直是听力学领域的研究热点，已有的研究证明多种生物学过程参与到老年性聋的病理生理机制中，比如耳蜗毛细胞的氧化应激、自噬与凋亡、炎症反应、耳蜗血管内皮细胞的损伤、线粒体DNA突变和离子跨膜转运障碍等[11]。老年性聋的相关基因及蛋白表达的研究，对其诊断、治疗和预后都有深远意义。

本研究基于GEO数据库，通过生物信息学分析，最终发现 PTPRC、MMP9、IGF1在PPI网络中起到关键节点基因的作用。

3.1 蛋白酪氨酸磷酸酶受体C型（protein tyrosine phosphatase receptor type C，Ptprc）

Ptprc编码的蛋白质是蛋白质酪氨酸磷酸酶(PTP)家族的成员，也称CD45抗原，可以特定地进行酪氨酸去磷酸化[12]。CD45是重要的免疫调节剂，可将Src家族激酶的成员去磷酸化来增强激酶活性，进而启动T细胞抗原受体与抗原呈递细胞结合后的抗原识别过程、控制T细胞活化阈值或增强B细胞中抗原介导的信号传导[13-15]。

Ptprc在神经退行性疾病中具有众多作用。Ptprc促进阿尔兹海默病（Alzheimer’s disease，AD）和帕金森病的发展，神经小胶质细胞高表达CD45，而CD45的交联可以负调控Src/p44/42 MAPK级联反应进而导致小胶质细胞失活[16,17]。在AD啮齿动物模型中，Ptprc活性缺乏会导致神经毒性Aβ寡聚体的积累[18]。Virginie Bottero等在识别区分帕金森病和进行性核上性麻痹的标志物研究中，发现Ptprc参与神经退化，并可能是一个潜在的治疗靶点[19]。而神经退行性病变是老年性聋的重要发病机制之一。

我们的分析结果显示，Ptprc在老年性聋小鼠耳蜗组织中的表达水平显著上调，参与蛋白去磷酸化、钙离子释放、外部凋亡信号通路的正调控、Fc γ受体介导的吞噬作用等多个富集的功能和通路。作为PPI网络中的关键节点基因，Ptprc和多种基因编码的分子进行广泛地相互作用。综合既往研究和我们的分析结果，Ptprc可能参与神经退行、氧化应激、凋亡与炎症过程进而从多方面促进老年性聋的发生发展。

3.2 基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，Mmp9）

Mmp9属于基质金属蛋白酶（MMP）家族，编码IV型胶原酶，是锌依赖的内肽酶，细胞外基质降解过程中的主要蛋白酶。

人们对Mmp9在听力相关疾病中的作用已经有了一些认识和猜想。Yang Dong等人推测Mmp9的高表达可以通过破坏细胞外基质和神经膜引起听力损失，最终导致听觉皮层和海马神经元功能障碍[20]。有研究发现，老年性聋伴随着C57BL/6J小鼠海马CA3区突触的退化[21]，而Mmp9在突触可塑性和认知过程中起着至关重要的作用[22]。脆性X综合征(Fragile X Sydrome,FXS)患者表现有听觉过敏症状，MMP9的缺失可以减缓听觉过敏症状，提示异常的MMP9表达是FXS听觉过敏的潜在机制[23]。Bhargava等人发现MMP9基因消融能够减轻高同型半胱氨酸血症引起的认知和听力功能障碍[24]。另外，噪音暴露会上调听觉皮质细胞质晚期糖基化终末产物受体（the receptor for advanced glycation end-products，RAGE）和促炎细胞因子TNF-α、IL6、IL-1β和NF-κB的表达，但抑制Mmp9后这种反应可以得到缓解[25]。还有研究发现，抑制Mmp9能够中断维持氧化应激和神经炎症之间不良作用的恶性循环[26]。此外，Mmp9可能通过激活炎性细胞因子级联反应[26]、降解硫酸软骨素蛋白多糖[27]，抑制短蛋白聚糖的表达[28]等途径调控听觉皮质周围神经网络。

我们的分析结果显示，Mmp9在老年性聋小鼠耳蜗组织中表达上调，主要存在于细胞外，参与白细胞跨内皮迁移、凋亡过程的调控、细胞外基质重组、血管生成、氧化应激反应、金属离子结合、半胱氨酸型内肽酶负调控等生物过程。因此，Mmp9可能主要通过神经炎症、氧化应激等机制在老年性聋疾病中发挥作用，这可能为其诊治提供新方向。

3.3 胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor 1，Igf1)

Igf1是胰岛素蛋白家族的成员，可以调节各种组织和器官中的细胞增殖、分化和凋亡。Igf1的生理病理作用通过多条分子信号通路来实现。例如，Igf1与其酪氨酸激酶受体结合并激活磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B(PI3K-Akt)通路和丝裂原活化的蛋白激酶-细胞外信号调节激酶（MAPK-ERK）通路，这两种通路都可以通过抑制细胞凋亡或促进细胞周期来调节细胞存活[29]。

已经有研究发现Igf1在感音神经性听力损失中发挥重要作用，在人群中，IGF1水平与听力损失程度呈负相关[30]。动物研究发现，Igf1通过支持神经祖细胞的神经发生、分化和增殖来促进内耳神经元发育[6]。Igf1还可以通过减轻耳蜗炎症和氧化应激的程度以及下调促凋亡基因的表达来促进耳蜗毛细胞存活[6,29,31]。

本研究的分析结果显示，36周龄小鼠耳蜗组织中Igf1的表达相对于7周龄小鼠显著下调。Igf1存在于细胞外、神经元胞体等部位，参与调控凋亡、神经系统发育、内耳发育、神经胶质细胞分化、MAPK活化、PI3K-Akt信号通路、神经元死亡、线粒体释放细胞色素c等众多分子功能和信号通路。由此可以看出，Igf1可能参与老年性聋的多种发病机制，并在内耳神经发育、细胞凋亡中发挥着重要作用。许多导致感音神经性听力损失的突变已在Igf1相关通路的基因中得到鉴定，Igf1因其对内耳听力的保护作用而备受关注，其在感音神经性听力损失的治疗中有很好的前景，但对于老年性聋疾病，其治疗靶点和潜力需要进一步研究来明确[32]。

值得一提的是，本研究所选取的DBA/2J小鼠是听力研究中使用最广泛的动物模型之一[33]，然而其具有早发性、年龄相关性听力损失的特点。DBA/2J小鼠的听力损失约在3到4周龄时出现，在2到3月龄时可进展为重度，这个过程伴随着快速进行性的耳蜗毛细胞的丢失以及螺旋神经节的变性[34]。不具备早发性听力丧失相关基因的小鼠在3月龄时仍具备正常的听力，因此DBA/2J小鼠作为研究生物老龄化的模型还是有待商榷，我们还需要新的动物模型验证研究结果。

综上所述，本研究基于生物信息学方法，层层分析，利用GSE6045数据集筛选出老龄化听力丧失相关的基因，利用GO和KEGG分析注释其基本功能及相关通路并加以验证。联系老年性聋疾病的生理病理表现及相对复杂的发病机制，重点分析了Ptprc、Mmp9及Igf1可能的作用机制，旨在为深入研究老年性聋的发病机制、早期诊断和靶向治疗提供新思路。