多种高效能氨基酸检测方法在饲料检验中的对比研究

2022-10-31黎媚媚

轻工标准与质量 2022年5期

黎媚媚

（广东省茂名市质量计量监督检测所，广东茂名 525000）

饲料中蛋白质的含量与畜牧业的发展密切相关[1-3]。将饲料中的蛋白质吸收为动物蛋白，可以大幅提高养殖的生长发育速度。蛋白质是养殖过程中需要摄入的必需营养素，蛋白质可以促进组织的再生和生命的新陈代谢，是构成生物组织细胞膜的重要部分。动物对蛋白质的需求来源于对氨基酸的需求。因而，饲料中含有的氨基酸种类和数量无疑是决定饲料品质的明显标志，对氨基酸的分析方法的研究一直受到高度重视。综上所述，选取合适的方法[4-6]检验饲料中的氨基酸成分刻不容缓。

目前，社会的发展对动物养殖的安全性提出了更严格的要求，必须掌握饲料中氨基酸和蛋白质的最佳含量，精准提高饲料中蛋白质的转化率，促进动物的养殖速度，降低饲料成本。在常用的动物养殖饲料中，鱼粉含有的氨基酸含量和配比较高，且其氨基酸的种类与养殖动物的氨基酸较为类似，该食品安全性较好，易消化，是动物蛋白的重要来源。所以，此次研究选择鱼粉作为研究对象，用于测量动物饲料含有的氨基酸。

1 实验准备工作

1.1 实验材料

饲料样品（大豆和鱼粉等混合饲料）；苏氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸和酪氨酸等氨基酸18 种，浓度均为99%。

1.2 实验药品

乙腈、甲醇、抗坏血酸、冰醋酸、草酸甲酯、苯酚、氯化钠、茚三酮、过氧化氢、2,4-二硝基氯苯、氢氧化锂、硝酸银、乙酸钠、醋酸-醋酸钠混合溶液、苯酚、盐酸、氢氧化钠、甲酸、低速离心机、碳酸氢钠。

1.3 实验设备

剪刀、饲料粉碎机、温控仪、涡旋仪、氨基酸分析仪、天平、电子天平、真空泵、镊子、培养箱、浓缩器、C18 色谱柱电烘箱、pH 酸度计、高效液相色谱仪、超声波清洗机、万能电烘箱、电加热烘箱、水浴等。

2 氨基酸检测方法

本次氨基酸检测依据GB/T 18246-2019《饲料中氨基酸的测定》，该标准规定了饲料中总氨基酸（肽键结合和游离的）和游离氨基酸（天然和添加的）测定方法，包括常规酸水解法、氧化酸水解法、碱水解法和酸提取法。

2.1 微波水解-氨基酸自动分析仪法

实际检测中，微波技术以其响应速度快、能量消耗低、操作较简便等优点逐渐进入人们的视野。采用微波碱解法对样品进行水解，既可以规避常规碱解的缺点，又可以方便地控制碱解过程。具有过程安全、节省时间、容易操作的优点。

2.1.1 样品的处理

选用脂肪低于5% 的饲料样品，精确称取0.010 0 mg～0.050 0 mg（要求精确到0.000 1 mg 级别），将其放于PTFE 消解管中，加入氢氧化钠溶液10 mL，然后充入氮气2 min。微波水解的碱浓度、水解温度和水解时间选择因子和正交试验条件。

取出PTFE 消解管，先将管置于常温冷却30 min，然后取出溶液放置于30 mL 容量瓶中，滴加5 mol/L 的HCl 溶液，中和溶液至中性状态，用水稀释至刻度。

2.1.2 分析统计方法

使用常见的SPSS 20.0 软件，对实验结果进行分析对比，多重对比时采用Duncan 法，将两种方法的结果采用t 检验进行比较。当P 小于0.01 时，认为是显著差异。

2.2 近红外光谱分析法

2.2.1 样品的处理

本实验的所有样品均由食品研磨机研磨，然后混合并储存在4℃的环境下保持。对于鱼粉饲料样品，进行脱脂、干燥、粉碎，然后冷藏备用。

2.2.2 饲料中氨基酸的检测

往饲料鱼粉的样品中添加一定量的蛋白质裂解液，制作氨基酸标准溶液[7-8]。将氨基酸标准溶液置于氨基酸分析仪，梯度洗脱法把各种氨基酸洗脱于溶液中，同时设置一组氨基酸标准溶液进行空白对照，利用湿法化学对所有样品鱼粉中的氨基酸进行检测。

2.2.3 样品数据的验证

实验中近红外光谱仪扫描分析鱼粉样品，通过对数据进行推测，对比以往的数据，根据t 检验方法，从而验证数据的科学性。

2.3 高效液相色谱法

2.3.1 样品溶液的配制

称量少许的动物饲料样品中常见的18种氨基酸的标准样品，保证其中氨基酸含量控制在60 mg～80 mg，放入250 mL 容量瓶中，使用0.1 mol/L 盐酸定容，摇匀溶解样品或将样品均匀分散在溶液中，得到1 000 mg/L 20 种氨基酸混合标准液，充入氮气，喷灯密封，然后放置烘箱（110±1）℃水解24 h，室温环境下冷却至常温。使用试管准确量取5 mL 该混合溶液，使用浓缩器对该试管浓缩处理，加入稀盐酸水解，取出上层清液保存在冰箱中供实验备用。

2.3.2 高效液相色谱的调节条件

条件设置为C18 型色谱柱，A 相为CH3OH 溶液；B 相为乙酸混合溶液，控制流动相的速度为1.5 mol/min；进样量10 μL，设定柱温32℃，选用紫外光的波长290 nm，等度洗脱，流动A 相:流动B 相=1:8。

2.3.3 饲料样品曲线的制备

分别选取浓度为25 mg/L、50 mg/L、150 mg/L、200 mg/L、250 mg/L、350 mg/L、450 mg/L、550 mg/L、650 mg/L 的氨基酸溶液各100 μL 的混合溶液，注入有机塑料膜处理，控制进液量为5 μL，通过软件测试。以盐酸浓度为横坐标，以氨基酸的峰面积值为纵坐标，作出鱼粉饲料的相关氨基酸图像。

3 实验结果与分析

3.1 不同检验方法下的水解条件对比

为研究分析不同检测方法对饲料中含有的氨基酸水解时间的影响，选取鱼粉和豆粕等测试样品进行预测试，按照定义的方法测试食品样品的氨基酸水解方法。

饲料氨基酸样品的微波水解处理温度为160℃，设定处理的时间为30 min。采用高效液相色谱法测定时，设定水解的温度控制在140℃，时间为15 min 时，鱼粉水解氨基酸的结果值与正常条件下的胺值较为接近；采用近红外光谱分析法测定时，设置水解的温度170℃，设置处理时间在27 min，鱼粉中水解氨基酸值远高于标准水解条件。综合比较三种方法下饲料鱼粉的氨基酸水解条件，认为高效液相色谱法处理时，氨基酸的水解时间最小，温度处理的时间也最短，水解效果也最好。

3.2 不同检验方法对氨基酸峰面积的影响

将饲料样品加入3 mol/L、5 mol/L、7 mol/L、9 mol/L、11 mol/L 不同浓度梯度的盐酸溶液中，放入水浴中进行水解，取上清液过滤，送入氨基酸分析或高效液相色谱法确定氨基酸的种类，以峰面积为指标，确定盐酸的最佳浓度。

如图1 至图3 所示，在各个氨基酸样品放入不同浓度的盐酸溶液，来检验各个氨基酸面积峰值。通过实验曲线可以看出，随着盐酸的浓度从3 mol/L 增至7 mol/L，氨基酸峰面积随着盐酸浓度的增加呈上升趋势。随后盐酸浓度逐渐增高，氨基酸峰面积逐渐减小。根据三种实验图像曲线可以看出，使用高效液相色谱法测量的一组，结果氨基酸峰面积值较高，且检测效果更好；而使用近红外光谱分析法测量的一组，结果氨基酸峰面积值很少，检测效果也相对更差。

图1 微波水解-氨基酸自动分析仪法测量时的氨基酸峰面积

图2 高效液相色谱分析法测量时的氨基酸峰面积

图3 近红外光谱分析法测量时的氨基酸峰面积

3.3 不同分析方法对饲料氨基酸测定结果的影响

如表1 所示，采用微波水解-氨基酸自动分析仪法时，检测结果中饲料中氨基酸组成成分与实际组成结果差距很大，各种氨基酸相似度的偏差范围在2.5%到 6.5%之间不等；采用近红外光谱分析法时，检测结果中饲料中氨基酸成分和含量与实际组成较为相似，各种氨基酸相似度的偏离范围约为0.22%到1.25%之间；采用高效液相色谱分析法检验时，检测结果中饲料中氨基酸成分和含量与实际基本相同，各种氨基酸相似度的偏差范围控制在0.02%～0.1%之间。根据实验检测方法对氨基酸结果的影响，发现高效液相色谱法进行检验时，饲料鱼粉中的氨基酸与实际情况基本相同，检验效果最小。

表1 不同分析方法对饲料氨基酸的组成影响（单位：mol/L）

3.4 不同检验方法对氨基酸稳定性的影响

如表2 所示，采用微波水解-氨基酸自动分析仪法时，检测结果中饲料中氨基酸稳定性与实际情况差距很大，各种氨基酸相似度的偏差范围在1.52%到5.55%之间不等；采用近红外光谱分析法时，检测结果中饲料中氨基酸稳定性与实际情况差距相对较小，各种氨基酸相似度的偏差范围在0.25%到0.86%之间；采用高效液相色谱分析法检验时，检测结果鱼粉饲料稳定性与实际情况基本相同，氨基酸的偏离范围控制在0.02%～0.11%之间。根据实验检测方法对氨基酸稳定性结果的影响，认为采用高效液相色谱法检验时，饲料鱼粉中的氨基酸与实际结果基本相同，对氨基酸稳定性影响最弱，结果偏差最小。

表2 不同分析方法对氨基酸稳定性的影响（单位：mol/L）

3.5 不同检验方法对氨基酸含量的影响

采用微波水解-氨基酸自动分析仪法时，检测结果中氨基酸的检验值大于实际正常值，各种氨基酸的变异系数较大；采用近红外光谱分析法时，检测结果中饲料中氨基酸的测量值略高于实际标准值，各种氨基酸的标准差在0.15%～0.25%之间；采用高效液相色谱法时，检测结果中饲料中氨基酸的测量值与实际标准值基本相似，各种氨基酸的标准差和变异系数最小。

综合分析实验结果表明，三种测定方法检验达到了检测饲料中氨基酸含量和组分的标准。