黄瓜CC-NBS-LRR家族基因鉴定及在霜霉病和白粉病胁迫下的表达分析

2022-10-31康忱赵雪芳李亚栋田哲娟王鹏吴志明

中国农业科学 2022年19期

康忱，赵雪芳，李亚栋，田哲娟，王鹏，吴志明

康忱，赵雪芳，李亚栋，田哲娟，王鹏，吴志明

河北省农林科学院经济作物研究所，石家庄 050051

【目的】对黄瓜全基因组的CC-NBS-LRR（CNL）基因家族进行生物信息学和表达模式分析，为深入研究CNL基因家族在黄瓜生长、发育和病害胁迫响应中的功能提供参考。【方法】以拟南芥为参考序列，利用本地perl语言和Pfam等软件检索黄瓜‘9930’基因组并确定黄瓜CNL基因家族成员。通过ExPASy、GSDS2.0、MEGA、MEME、Tbtools、Mev等工具对黄瓜CNL家族基因进行生物信息学分析。根据转录组数据库、霜霉病菌（）、白粉病菌（）接种处理和实时荧光定量PCR技术分析该类基因的表达模式。【结果】从黄瓜全基因组中鉴定得到17个，这些基因分布在除1号染色体外的6条染色体上，其编码蛋白与其他植物CNL结构相似，均含有CC、NBS和LRR保守结构域，蛋白质大小介于197—1 148 aa，分子量在22.6—131.3 kD，等电点在5.71—8.38。共线性分析表明其中不存在片段重复和串联重复基因，多物种系统进化关系表明，CsCNL基因家族成员在葫芦科植物之间具有较高的结构和功能相似性。启动子中存在多种与抗病相关的顺式作用元件。表达具有组织特异性。在接种霜霉病菌2 d和5 d后，、和在抗性品种中均显著上调表达，在抗性品种中下调表达，在敏感品种中显著性表现不一；在接种白粉病菌2 d和5 d后，和在敏感品种中显著上调表达，在抗性品种中显著下调表达；、和在抗性品种中显著上调表达，在敏感品种中表达量无变化或显著下调。【结论】CsCNL家族成员具有组织表达特异性并且多数基因能够响应霜霉病菌和白粉病菌的胁迫。推测、和表达量增加，表达量减少可诱发抗病黄瓜品种的霜霉病抗病反应；、和表达量增加，和表达量减少可诱发抗病黄瓜品种的白粉病抗病反应；而表达量的增加能同时诱发抗病黄瓜品种的霜霉病和白粉病的抗病反应。

黄瓜；CC-NBS-LRR（CNL）；霜霉病；白粉病；基因表达

0 引言

【研究意义】在与病原微生物共同进化的过程中，植物先天免疫系统会发挥至关重要的作用，保护自身免受生物或非生物胁迫的影响[1-2]。植物先天免疫系统主要包括两个层次：第一层次是病原物相关分子模式触发的免疫（pattern-triggered immunity，PTI）反应；第二层次是效应因子触发的免疫（effector-triggered immunity，ETI）反应，面对病原菌的入侵，植物进化出细胞内受体蛋白，主要为抗病基因（R基因）编码的R蛋白，不同的R蛋白可以直接或间接识别不同来源的病原物效应因子，并且激发相似的防卫反应[3-7]。CNL（coiled-coil nucleotide-binding site leucine-rich repeat，CC-NBS-LRR）作为R基因家族中非常重要的一类，在植物病害防御过程中具有重要作用。黄瓜（）为葫芦科一年蔓生或攀援草本植物，是我国重要的蔬菜作物之一。由古巴假霜霉菌（）侵染引起的霜霉病（downy mildew，DM）和由单囊壳白粉菌（）引起的白粉病（powdery mildew，PM）是黄瓜生产中极具破坏性的病害，给黄瓜生产带来巨大威胁[8-10]。鉴定并分析黄瓜可为研究该类基因在黄瓜霜霉病和白粉病防御中的作用提供基础数据。【前人研究进展】NBS-LRR基因家族是最大的一类R基因，其编码的NBS-LRR蛋白是一种核苷酸结合位点-富含亮氨酸重复序列，该蛋白能够保护植物靶点免受病原体效应蛋白的侵害。NBS结构域属于NB-ARC（nucleotide-binding adaptor shared by APAF-1，R proteins and CED-4）结构域，是ATP和GTP核苷酸结合所必需的关键区域，并在防御信号传输中起作用[11-12]。植物R基因编码的蛋白结构非常保守，最重要的特征之一就是具有LRR，LRR是NBS的C端富含亮氨酸重复序列的区域[13]。NBS-LRR类蛋白在植物各组织中均有分布，根据N端的不同，NBS-LRR蛋白分为TIR-NBS-LRR（toll/interleukin 1 receptor-NBS- LRR，TNL）类和non-TIR-NBS-LRR类，其中non-TIR- NBS-LRR包括CNL类和RPW8-NBS-LRR（resistance to powdery mildew 8-NBS-LRR，RNL）类。TNL类的N端包含TIR结构域，CNL类的N端包含CC结构域，RNL类的N端包含RPW8结构域[14-15]。目前，多种植物的NBS家族成员已被报道，如粳稻[16]、大豆[17]、马铃薯[18]、木薯[19]、高粱[20]、野生刺葡萄[21]等。从中可以发现不同物种CNL家族成员的数量存在很大差异，大白菜、高粱、马铃薯、粳稻、油菜、木薯及谷子中分别鉴定出40、33、65、159、17、117和33个[16,18-20,22-24]。研究发现CNL家族在多种植物抗病过程中发挥作用。是最初从六倍体小麦中分离的能够高抗小麦叶锈病的[25]；（）是编码CNL蛋白的稻瘟病抗性基因[26]；能够抵抗由f. sp.（）引起的小麦白粉病[27]；能抵抗由条形柄锈菌小麦专化型（f. sp.，）引发的条锈病[28]。2013年，Wan等[29]已对黄瓜基因组中NBS-LRR家族成员进行了结构和进化分析，鉴定出57个NBS-LRR基因家族成员。【本研究切入点】虽然黄瓜NBS-LRR基因家族以及其成员在抗病方面的功能已有报道[30]，但还未见针对黄瓜CNL（CsCNL）家族的研究报道，且该家族成员在防御霜霉病和白粉病等真菌病害侵染方面的作用尚不明确。【拟解决的关键问题】利用生物信息学方法在黄瓜全基因组范围内对CsCNL基因家族成员进行鉴定，并对其染色体位置、基因结构、进化分化特征以及物种间的共线性进行分析，构建不同物种CNL蛋白系统发育树阐明进化过程。检测并分析在黄瓜不同组织和霜霉病菌、白粉病菌侵染下的表达情况，为进一步研究CsCNL家族基因的生物学功能及其对霜霉病和白粉病的响应打下基础。

1 材料与方法

试验于2021年在河北省农林科学院完成。

1.1 材料和处理

供试材料为黄瓜品种‘9930’‘PI 197088’和‘EOM402-10’。将供试黄瓜材料播种于育苗温室，选取三片真叶期的幼苗进行霜霉病菌和白粉病菌接种，均采用孢子悬浮液喷雾接种法。霜霉病菌：从田间发病植株上采摘新鲜病叶，将发病部位的新鲜霉层用消毒软毛刷刷入无菌水中，用血球计数法统计浓度，配成浓度为5×105个/ml的孢子悬浮液。白粉病菌：从田间发病植株上采集白粉病菌孢子，同样用无菌水将病菌配成浓度为5×105个/ml的孢子悬浮液。接种幼苗置于相对湿度100%的培养箱中处理48 h，然后将植株放置于温度24—28℃，光照强度为2 000 1x，光周期为光照16 h/黑暗8 h的温室中培养。分别在处理0、2和5 d后采集接种病菌的植株叶片，经液氮速冻后置于-80℃冰箱中保存，用于后续实时荧光定量PCR（qRT-PCR）法验证接种病原菌后在抗性品种和敏感品种中的表达差异。

1.2 CsCNL家族成员的获得与鉴定

从黄瓜基因组数据库CuGenDB（Cucurbit Genomics Database）（http://www.cucurbitgenomics.org/organism/ 2）下载“黄瓜基因组9930_V2版本”（‘9930’作为参考基因组）基因组数据。从TAIR数据库（https:// www.arabidopsis.org/）获得拟南芥（）CNL基因家族的基因ID和氨基酸序列信息。利用BioEdit软件，以e-5为临界值选取候选，用本地Perl语言提取候选基因蛋白序列，初步获得CsCNL基因家族成员。结合下载于Pfam数据库（https://pfam.xfam.org/）的CNL蛋白的NBS、CC和LRR保守结构域，使用Pfam中的HMMScan和PfamScan对上一步获得的候选基因进行结构域分析，剔除不含CNL蛋白典型结构域的序列，确定CsCNL基因家族的最终成员。

1.3 CsCNL家族基因生物信息学分析和系统进化树构建

通过ExPASy网站（https://web.expasy.org/compute _pi/）对CsCNL家族蛋白的等电点和分子量进行预测。利用在线网站MEME（https://meme-suite.org/meme/ index.html）进行motif预测，数量设置为15个，其余参数选择默认。提取CsCNL基因家族成员的gff文件信息，通过Gene Structure Display Server 2.0（GSDS2.0）网站（http://gsds.gao-lab.org/）进行基因结构分析。从黄瓜基因组序列注释文件中提取每个的染色体位置，利用MapGene2Chrom web v2（MG2C）在线网站（http://mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/）绘制基因在各条染色体上的位置图谱。利用TBtools中的MCscanX分析黄瓜、甜瓜、西瓜、拟南芥、玉米和高粱CNL家族成员之间的同源性，生成共线性分析图。

使用软件MEGA 7.0分别对黄瓜、甜瓜、西瓜、拟南芥、玉米和高粱中CNL的蛋白序列进行多重比较，通过邻接法（neighbor-joining，NJ）构建进化树，设BootStrap抽样次数为1 000，其余参数默认。

1.4 CsCNL家族基因启动子区顺式作用元件分析

为了分析CsCNL家族基因启动子区域包含的顺式作用元件，利用TBtools软件提取每个起始密码子‘ATG’上游2 000 bp的序列， PlantCARE在线网站（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/ plantcare/html/）对顺式作用元件进行预测，然后使用Mev软件对选取的抗病相关的顺式作用元件进行作图分析。

1.5 CsCNL家族蛋白三维结构的同源建模

蛋白质的三维结构对于理解其功能非常重要，为了从分子水平上了解蛋白质的作用机制，通过同源建模方法进一步预测CsCNL蛋白的三维结构。首先，使用位置特定的迭代BLAST算法（PSI-BLAST）在PDB数据库（http://www.rcsb.org/）中找到最相似的同源蛋白[31]，然后使用Swiss-Model在线网站（https:// swissmodel.expasy.org/interactive/）预测CsCNL蛋白的三维结构[32]。

1.6 基于转录组测序数据的基因组织表达与病害响应分析

为了确定的组织表达特异性，从黄瓜基因组数据库CuGenDB（Cucurbit Genomics Database）下载并分析相关的RNA-seq数据：10个黄瓜组织（根、茎、叶、子房（未膨大）、未受精子房（已膨大）、受精子房（已膨大）、雌花、雄花、卷须和卷须基部的转录组数据）（PRJNA80169）；接种霜霉病菌的霜霉病抗性品种‘PI 197088’的转录组数据）（PRJNA388584）和接种白粉病菌的白粉病抗性品种‘SSL508-28’的转录组数据）（PRJNA321023）。

1.7 CsCNL家族基因表达分析

使用植物总RNA提取试剂盒（天根，北京）从样品中提取总RNA，PrimeScriptTMRT reagent Kit试剂盒（TaKaRa，北京）完成第一链cDNA的合成，使用的仪器为ABI PRISM 7500（操作软件为7500 Fast Real-Time PCR Systems，v2.0.6，USA），荧光染料为TB Green，试剂盒为TaKaRa公司的TB Green® Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）。使用Primer Premier 3在线设计特异性引物，序列如表1所示。qRT-PCR反应体系为10 μL，包含5 μL的TB Green Premix Ex Taq（Tli RNaseH Plus）（2×），1 μL cDNA模板，primer-F/R（终浓度为0.2 μmol·L-1）各0.2 μL，0.2 μL ROX Reference Dye II（50×），3.4 μL ddH2O。反应程序：95℃预变性30 s；95℃变性5 s，60℃延伸34 s，40个循环；72℃ 20 s。（）为内参基因。使用2-∆∆CT算法分析基因的相对表达量。

表1 实时荧光定量PCR引物序列

2 结果

2.1 CsCNL家族基因的全基因组鉴定

通过序列分析，共鉴定得到17个。图1为在染色体上的位置图谱，17个分布在除1号外的6条染色体上，1—7号染色体上基因数目分别为0、3、4、5、1、1和3。根据基因片段的复制关系进行共线性分析，其中不存在片段重复基因和串联重复基因。CsCNL蛋白的氨基酸残基数目在197—1 148，分子量在22.6—131.3 kD，蛋白等电点在5.71—8.38（表2）。

图1 CsCNL家族基因在染色体上的位置

表2 CsCNL家族基因全基因组鉴定与分子特征分析

2.2 CsCNL家族基因结构和进化分析

CsCNL家族基因外显子数目差异明显，为1—5个不等，其中有6个基因含有1个外显子，8个基因含有2个外显子，1个基因含有3个外显子，2个基因含有5个外显子（图2-A）。CsCNL蛋白均含有该家族的CC、NBS和LRR保守结构域，有14个家族成员含有10—15个motif，有3个成员含有6—7个motif（图2-B）。

图2 CsCNL家族成员基因的结构（A）及保守基序motif（B）

使用MEGA 7.0和在线软件ITOL对黄瓜、甜瓜、西瓜、拟南芥、玉米和高粱中的CNL家族蛋白序列进行系统进化树构建。如图3所示，根据其蛋白序列特征分为7个亚组，即Group 1—Group 7。最大的亚组为Group 4，有30个成员，最小的亚组为Group 5，有13个成员组成。绝大部分黄瓜、甜瓜和西瓜CNL家族成员集中在Group 1中，个别成员出现在Group 4、Group 6和Group 7。拟南芥CNL家族成员集中在Group 4、Group 5、Group 6和Group 7，单子叶植物玉米和高粱CNL家族成员在除Group 1外的6个亚组均有分布。

为了进一步了解CsCNL家族基因的进化关系，通过软件MCscanX对黄瓜与甜瓜、西瓜、拟南芥、玉米、高粱中CNL家族基因进行了物种间共线性分析，结果如图4所示，和家族基因之间有3个同源基因对；和家族基因有3个同源基因对；与、、家族基因之间没有共线性基因。就单条染色体上的共线性基因分布而言，黄瓜的3号、4号和7号染色体上共线性基因分别为2条，其余染色体上为0条。

2.3 CsCNL家族基因启动子中顺式作用元件分析

利用在线网站PlantCARE对CsCNL家族中各基因启动子区域的顺式作用元件进行预测和分析。除去位于转录起始点上游的TATAbox、CAAT-box和启动子5′端上游调控区含有的分生组织、胚乳、种子细胞等调控元件和生物过程中涉及到的代谢、昼夜节律、细胞周期等响应元件，的启动子中包含10种参与抗病响应的顺式作用元件（W-box、ERE、GT1-motif、G-box、as-1、JERE、S-box、P-box、TGACG-motif和TC-rich repeats）以及植物激素响应元件（图5）。W-box是一类植物病原诱导相关基因的顺式作用元件，ERE元件能够调控真菌诱导表达，分别存在于10个启动子中，共有19项和27项。共有8个在其启动子中包含GT1-motif。G-box和as-1元件分别存在于13个和11个启动子中，共有31项和26项。JERE元件和调控真菌诱导表达的S-box及P-box相似，存在于少数启动子中。大多数启动子中含有响应茉莉酸（JA）途径的TGACG-motif和响应免疫防御反应的TC-rich repeats。分别有12个启动子中含有茉莉酸甲酯（MeJA）和水杨酸（SA）响应元件。

图3 不同物种CNL家族蛋白的系统发育分析

2.4 CsCNL家族蛋白同源建模

使用基于同源性的建模方法进一步预测了这些CsCNL蛋白的三维结构。大多数CsCNL蛋白的建模三维结构在叠加时相对于相应的同源模板显示小于1Å的均方根偏差（RMSD），表明预测是可靠的。结果表明，Csa7G425930由-螺旋组成，除此之外的16个CsCNL蛋白具有相似的三维结构，均由-螺旋、-折叠以及不规则卷曲组成（图6）。结构的上半部分由-螺旋、-折叠和不规则卷曲组成，下半部分由3—4个-螺旋组成，内部形成疏水腔。

2.5 CsCNL家族基因的组织表达分析

利用从黄瓜基因组数据库CuGenDB下载的RNA-seq数据，分析了CsCNL家族基因的组织表达情况（图7-A）。其中、、、、、和在各组织中的表达量较高；、、、和在各组织的表达量较低；、、、、、、、和在未受精子房中的表达量最高，推测这些基因可能对黄瓜未受精子房的生长有重要作用；和在茎中的表达量最高，推测该基因可能对黄瓜茎的生长发挥重要作用；在抵抗病虫害过程中发挥重要作用的叶片中，、、、、、、和的表达量较高。在各组织中的表达水平不同，表明其成员功能的分化和组织表达的特异性。

背景中灰色线条表示基因组中的共线区域，红色线条突出显示共线的CNL基因对

2.6 CsCNL家族基因在霜霉病菌和白粉病菌处理下的表达分析

利用黄瓜基因组数据库下载来自黄瓜幼苗在霜霉病菌以及白粉病菌处理后的RNA-seq数据。霜霉病抗性品种‘PI 197088’在接种霜霉病菌0、6和24 h的表达情况见图7-B，大部分受霜霉病菌的诱导表达，其中、、、和在诱导后6 h和24 h上调表达；在诱导后6 h上调表达；在诱导后24 h上调表达；和在诱导后6 h下调表达，24 h上调表达；、、和在诱导后6 h和24 h下调表达；在6 h、在24 h下调表达；和两个基因表达无显著变化。

白粉病抗性品种‘SSL508-28’在白粉病菌处理48 h的表达情况见图7-C，其中、、、、、和在接种白粉病菌后表达量升高；、、和在接种白粉病菌后表达量降低；其余基因没有明显的表达差异。

数字表示顺式作用元件的数量The numbers represent the amount of cis-elements

图6 CsCNL家族蛋白的三维结构

A：组织表达模式Expression profiles of different tissues。Female：雌花Female flower；Leaf：叶；Male：雄花Male flower；Ovary_fertilized：受精子房；Ovary：子房；Ovary_unfertilized：未受精子房；Root：根；Stem：茎；Tendril_base：卷须基部；Tendril：卷须。B：在霜霉病菌处理下的表达模式Expression patterns after treated by P. cubensis。C：在白粉病菌处理下的表达模式Expression patterns after treated by P. xanthii

通过qRT-PCR检测在霜霉病菌接种敏感品种‘9930’和抗性品种‘PI 197088’后0、2和5 d的表达量，如图8所示，在接种2 d后，、、、、和在抗性品种和敏感品种中显示出相似的表达趋势，均上调表达，其中在抗性品种‘PI 197088’中的表达水平高于敏感品种‘9930’；、和在两个品种中表现出相反的表达特征，其中和在敏感品种中显著下调表达，在抗性品种中显著上调表达，在敏感品种中显著上调表达，在抗性品种中显著下调表达。接种5 d后，、和在两个品种中均上调表达，均下调表达；、和在两个品种中表现出相反的表达特征，其中和在敏感品种中显著下调表达，在抗性品种中显著上调表达，在敏感品种中显著上调表达，在抗性品种中显著下调表达；和在敏感品种中显著上调表达，在抗性品种中无显著变化；和在抗性品种中显著下调表达，在敏感品种中无显著变化。

处理与对照的差异显著性分析用t-test法统计Significance differences between treatment and control were analyzed by t-test. * α=0.05，**α=0.01。图9同The same as Fig. 9

综合接种后的两个时间点，和均下调表达，和无显著变化。、和在抗性品种中均显著上调表达，在敏感品种中显著性表现不一致，而在抗性品种中下调表达，敏感品种中表现不一，结合上述转录组数据，这4个基因在各组织尤其是叶片中是有一定表达量的（图7-A、7-B），推测、、和为黄瓜抗霜霉病的R基因，、和表达量增加可诱发抗病黄瓜品种的抗病反应，而表达量减少可诱发抗病黄瓜品种的抗病反应。

如图9所示，利用qRT-PCR检测在白粉病敏感品种‘9930’和抗性品种‘EOM402-10’接种白粉病菌0、2和5 d后的表达量，、、、和在两个时间点的表达趋势一致，和上调表达，、和均下调表达。和在敏感品种中显著上调表达，在抗性品种中无显著变化。接种后5 d、接种后2 d、和接种后2 d和5 d在两个品种中表现相反的表达特征。在两个时间点没有显著的表达变化。

在接种后的两个时间点，和在敏感品种中显著上调表达，在抗性品种中显著下调表达；、和在抗性品种中显著上调表达，在敏感品种中表达量无变化或显著下调。结合上述转录组数据，这5个基因在各组织尤其是叶片中是有一定表达量的（图7-A、7-C），推测、、、和为黄瓜抗白粉病的R基因，、和表达量增加可诱发抗病黄瓜品种的抗白粉病反应，而和表达量减少可诱发抗病黄瓜品种的抗白粉病反应。

3 讨论

3.1 CsCNL家族成员结构分析

植物抗病基因（R基因）识别引发的植物抗性反应还包括防御基因表达增加、活性氧的产生、水杨酸的产生或释放、离子通量等因素[33]。NBS-LRR蛋白可以直接或间接识别病原体的存在，对多种病原体的特异性识别需要大量R基因的活性。本研究中通过生物信息学分析，发现黄瓜中CC型NBS-LRR家族包含17个基因，分布在除1号外的6条染色体上。物种内共线性分析表明，17个成员之间不存在片段重复和串联重复的现象。CsCNL蛋白均含有该家族的保守结构域CC、NBS和LRR，motif数目为6—15个不等，这些motif在基因家族中的分布表现出比较相似的模式（图2）。不同物种蛋白系统发育分析和物种间共线性分析均表明CNL基因家族成员在葫芦科植物之间具有较高的结构和功能相似性（图3、图4）。通过同源建模对CsCNL蛋白的三维结构进行预测，除Csa7G425930由-螺旋组成外，其余CsCNL蛋白均具有相似的三维结构，上半部分由-螺旋、-折叠和不规则卷曲组成，下半部分由3—4个-螺旋组成，内部形成疏水腔，该疏水空腔在体外可以结合或转移脂肪酸、脂肪酰基-CoA、磷脂和糖脂等疏水分子[34-35]。这些蛋白质的建模三维结构为研究其生物学功能打下了基础。

3.2 CsCNL家族基因可能参与黄瓜霜霉病和白粉病防御过程

启动子是位于基因5′端上游的一段负责调控基因转录的DNA序列，其中顺式作用元件的类型表明基因的潜在功能。与植物抗病相关基因的启动子区含有能针对病原菌胁迫作出应答的顺式作用元件，这些顺式作用元件通过与转录因子特异性结合，进而增强抗病基因的转录表达，提高植物的抗病性。CsCNL家族基因的启动子中存在多种抗病相关的顺式作用元件以及植物激素响应元件，其中，ERE元件能够调控真菌诱导表达；W-box是与植物病原诱导相关的SA响应元件[36-37]；GT1-motif的表达由病原体诱导，部分与GT-1-like转录因子相互作用，GT-1-like转录因子结合病程相关（PR）PR-1a启动子，影响SA诱导基因的表达水平[38]。G-box是能够应答一些环境因子（如脱落酸、光照、紫外线、伤害以及病原物信号）的顺式作用元件；as-1元件是参与信号（包括SA、植物生长激素、茉莉酮酸酯和过氧化氢）应答的植物防御反应元件，G-box和as-1元件都能与bZIP蛋白结合[39]。JA能诱导许多植物产生防卫应答反应，合成一些与防卫相关的次生代谢产物，能够调控JA诱导表达的JERE元件和调控真菌诱导表达的S-box及P-box相似，存在于少数启动子中。P-box最初是在欧芹启动子上发现的受真菌激发子诱导的DNA-蛋白互作位点，可与MYB类蛋白BPF-1结合[40]。绝大多数启动子中含有响应JA途径的TGACG-motif和响应免疫防御反应的TC-rich repeats。JA途径主要响应死体型病原菌的侵入，而SA途径主要响应活体营养性病原菌的侵入[41-42]。上述顺式作用元件通过与转录因子特异性结合，进而增强抗病基因的转录表达，提高植物的抗病性。

图9 白粉病菌处理后CsCNL的实时荧光定量PCR表达分析

目前已有越来越多的在病害防御过程中的功能被报道，例如小麦叶锈病[25]、小麦条锈病[28]、稻瘟病[26]、小麦白粉病[27]。在本研究中，如图8和图9所示，在黄瓜霜霉病菌和白粉病菌侵染过程中呈现不同的表达模式，表明在抵御黄瓜霜霉病和白粉病过程中发挥着重要作用，其具体作用取决于病原体种类和接种时间。其中，推测、、和这4个基因为黄瓜抗霜霉病的R基因，、和表达量增加，表达量减少可诱发抗病黄瓜品种的霜霉病抗病反应。而、、、和这5个基因为黄瓜抗白粉病的R基因，、和表达量增加，和表达量减少可诱发抗病黄瓜品种的白粉病抗病反应。目前已有研究证明控制黄瓜霜霉病和白粉病的QTL共定位，认为霜霉病和白粉病抗性具有显著的相关性[43-44]。在霜霉病菌和白粉病菌诱导下，在相应的时间点显示出相似的表达趋势，表明在参与霜霉病和白粉病的防御反应过程中可能具有相似的作用机制，表达量的增加能同时诱发抗病黄瓜品种的霜霉病和白粉病抗病反应。

4 结论

从黄瓜全基因组中鉴定出17个CsCNL家族成员，其在葫芦科植物之间具有较高的结构和功能相似性，家族成员具有组织表达特异性并且多数基因能够响应霜霉病菌和白粉病菌的胁迫，表明在抵御黄瓜霜霉病和白粉病过程中发挥着重要作用。

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Genome-Wide Identification and Analysis of CC-NBS-LRR Family in Response to Downy Mildew and Powdery Mildew in

KANG Chen, ZHAO XueFang, LI YaDong, TIAN ZheJuan, WANG Peng, WU ZhiMing

Institute of Cash Crops, Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences, Shijiazhuang 050051

【Objective】The bioinformatics and expression pattern analysis of the CC-NBS-LRR (CNL) gene family of the whole cucumber () genome was carried out to provide a reference for further study of the functions of the CsCNL gene family in growth, development and disease stress response.【Method】Taking thegene sequence ofas the reference, the genome of cucumber ‘9930’ was searched by local perl language and Pfam software, and the members of CsCNL gene family were identified. CsCNL gene family was analyzed bysome bioinformatics tools, such as ExPASY, GSDS2.0, MEGA, MEME, Tbtools and Mev. Transcriptome data, inoculating with downy mildew and powdery mildew pathogens (and) and real-time quantitative PCR (qRT-PCR) were used to evaluate the expression of the genes.【Result】A total of 17genes were identified from cucumber genome.genes are distributed on 6 chromosomes except chromosome 1. The encoded proteins are similar in structure to other plant CNLs. All CsCNL proteins contain conserved domains of CC, NBS and LRR. The amino acid sequence size ranged from 197 to 1 148 aa, with a molecular weight (MW) of 22.6 to 131.3 kD, and a protein isoelectric point (PI) ranged from 5.71 to 8.38.Collinear analysis showed that there were no segmental duplication and tandem duplication genes, and the multi-species phylogenetic relationship showed that CNL gene family members had high structural and functional similarities among Cucurbitaceae plants. There were many cis-acting elements related to disease resistance in the promoter ofgenes. The expression ofgenes was tissue-specific.At 2 d and 5 d after inoculation with,,andwere all significantly up-regulated in resistant variety,was down-regulated in resistant variety, and significantly different in susceptible variety. At 2 d and 5 d afterinoculation,andwere significantly up-regulated in susceptible variety and significantly down-regulated in resistant variety.,andwere significantly up-regulated in resistant variety, while unchanged or significantly down-regulated in susceptible variety.【Conclusion】CsCNL gene family has specific expression pattern in different tissues, and most of thegenes were induced byand. It is speculated that the increased expression of,and, and the decreased expression ofcan induce downy mildew resistance in resistant cucumber varieties. The increased expression of,and, and the decreased expression ofandcan induce the resistance to powdery mildew in resistant cucumber varieties, while the increased expression ofcan simultaneously induce disease resistance to downy mildew and powdery mildew in resistant cucumber varieties.

cucumber (); CC-NBS-LRR (CNL); downy mildew; powdery mildew; gene expression