茎尖脱毒技术的优化研究——以草莓、丹参、魔芋为例

韦献雅， 谢尚春， 欧阳丽莹， 潘 霞

(成都农业科技职业学院， 四川 成都 611130)

茎尖脱毒技术是无性繁殖作物提纯复壮的主要技术手段，其原理是病毒在植物体内分布不均一，越接近生长点(0.1～1.5 mm区域)，病毒浓度越稀。因此，有可能采用小的茎尖离体培养而脱除植物病毒。传统茎尖脱毒的主要流程是：在大田中采回要脱毒作物的芽(1～2 cm)，常规消毒，在超净工作台上把茎芽置于解剖镜下(8～40倍)，用解剖针将叶片和叶原基剥掉,用解剖刀片将分生组织切下来，然后将其接种到培养基上，将接种好的茎尖置于25 ℃左右的温度下，每天在 2 000～3 000 lx的光照条件下培养16 h，3～6个月形成再生苗，进行病毒检测，不带毒的再生苗即为脱毒苗[1]。

无性繁殖作物草莓、丹参、魔芋、蓝莓、马铃薯等种植面积大、经济效益高，是扶贫和农业产业结构调整的主导作物，优质脱毒种苗种薯的应用与推广对产业发展至关重要。

目前这些作物面临病毒病种类多、危害严重、种性退化快、种苗(薯)质量差等问题。常规茎尖脱毒技术效率低，脱毒不彻底，因此需要对茎尖脱毒技术进行优化，形成高效的茎尖脱毒技术。本研究优化了草莓、丹参和魔芋的茎尖脱毒技术，为无性繁殖特色作物产业发展升级提供技术支撑。

1 材料和方法

1.1 供试材料

草莓匍匐茎、丹参活体植株、魔芋萌芽的块茎。

1.2 实验方法

1.2.1优株热处理茎尖脱毒技术(以草莓为例)

优株热处理茎尖脱毒技术流程[2-3]：

1)选材并热处理：选用生产上主栽优良品种的优良草莓单株，选择果形好、分蘖强、产量高、抗性好的植株作茎尖剥离材料。放置在光照培养箱中长光照高温热处理培育一周(36～38 ℃，16 h光照；8 h黑暗，30～32 ℃)(图1)。

图1 草莓优株热处理

2)培养基制备：培养基使用MS+6-BA 0.5 mg/L+ NAA0.05 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂7 g/L，pH 5.8，熬制好后分装入瓶。

3)灭菌：在0.12 MPa/cm2压力下灭菌20～23 min，冷却备用。

4)茎尖剥离接种：将入选材料(草莓匍匐茎芽尖)放入纱布袋，放1～2滴洗洁精，用自来水冲洗1 h，倒掉水在超净工作台用75%酒精中浸20～30 s，再用2%次氯酸钠溶液消毒10～15 min，取出用无菌水冲洗3～5次，用灭菌滤纸吸干材料表面水分，在体视解剖镜下用手术刀等工具轻、准、快速地剥去幼叶(图2)，切取带2～4个叶原基(1.0～1.5 mm)的生长点，放入培养基的培养瓶中，每瓶放1个生长点。注明品种，茎尖号，接种日期。

图2 草莓优株热处理茎尖剥离

5)培养条件：日温21～25 ℃，夜温15～18 ℃，光照时数12～14 h/d，光照强度2 000～3 000 lx。

6)病毒检测：酶联免疫法，主要检测草莓斑驳病SMOV、草莓镶脉病毒SVBV、草莓皱缩病毒SCRV、草莓轻型黄边病毒SMYEV，合格的脱毒苗用于继代培养。

脱毒再生苗生根移栽，繁育脱毒种苗，将脱毒种苗栽种大田繁育果实，同时种植传统繁育的种苗繁育果实，记录数据进行分析。

1.2.2二次剥离茎尖脱毒技术(以丹参为例)

二次茎尖剥离脱毒技术流程[4-6]：

1)选材和第一次茎尖培养：选用生产上主栽品种丹参的优良单株(产量高、药效含量高、抗性好)作茎尖剥离材料。

2)培养基的制备：培养基使用MS +蔗糖30 g/L+琼脂7 g/L，pH=5.8，熬制好后分装入管瓶。

3)灭菌：在0.12 MPa/cm2压力下灭菌20～23 min，冷却备用。

4)茎尖剥离接种：将1～2 cm的芽尖放入纱布袋，放入1～2滴洗洁精，用自来水冲洗1 h后，倒掉水拿到超净工作台在75%酒精中浸20～30 s，再用2%次氯酸钠溶液消毒10～15 min，取出用无菌水冲洗3～5次，用灭菌滤纸吸干材料表面水分，接种在培养基上培养。

5)丹参组培苗长到3～4 cm，在超净工作台中用体视解剖镜、手术刀等工具轻、准、快速地剥去幼叶，切取带1～2个叶原基(0.2～0.5 mm)的生长点(图3)，放入培养基的试管或培养瓶中，每管(瓶)放1个生长点。注明品种，茎尖号，接种日期。统计成活率。

图3 丹参二次茎尖剥离

6)培养条件：日温21～25 ℃，夜温15～18 ℃，光照时数12～14 h/d，光照强度2 000～3 000 lx。

7)病毒检测方法：直接观察法，由于目前丹参还没有试剂盒能检测病毒，筛选的方法采用优株正向选择，淘汰带有病毒病症的劣株。因此剥离茎尖时一定要剥离0.2～0.5 mm，脱毒效果在实验室阶段通过组培苗的健康程度判断筛选，栽种后通过田间农艺性状判断脱毒效果进行筛选。

1.2.3抗褐化茎尖脱毒技术(以魔芋为例)

抗褐化茎尖脱毒技术流程[7-8]：

1)选材：选用优良块茎(个头大、无病害、外观漂亮)作茎尖剥离材料。

2)培养基的制备：培养基使用MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂7 g/L，pH=5.8，培养基中分别加入1%柠檬酸、0.3%活性炭、1%抗坏血酸、0.01 PVP，熬制好后分装入瓶。同时配制500 mL 1%柠檬酸同时灭菌。

3)灭菌：在0.12 MPa/cm2压力下灭菌20～23 min，冷却备用。

4)茎尖剥离接种：将入选材料放入纱布袋，用自来水冲洗1 h后，倒掉水拿到超净工作台在75%酒精中浸20～30 s，再用0.1%升汞液消毒6～8 min(或用2%次氯酸钠溶液消毒10～15 min)，取出用无菌水冲洗3～5次，用灭菌滤纸吸干材料表面水分，在体视解剖镜下用手术刀等工具轻、准、快速地剥去外层鳞片，切取带1～2个叶原基(0.2～0.5 mm)的生长点，放入培养基的培养瓶中，每瓶放1个生长点。注明品种、茎尖号、接种日期。

5)培养条件：日温21～25 ℃，夜温15～18 ℃，光照时数14 h/d，光照强度3 000 lx。

6)病毒检测：直接观察法。由于目前魔芋还没有试剂盒能检测病毒，因此剥离茎尖时一定要剥离0.2～0.5 mm，实验室阶段通过组培苗的健康程度做出判断，栽种后通过田间农艺性状判断脱毒效果。

2 结果与分析

2.1 草莓优株热处理茎尖剥离技术

利用草莓优株热处理茎尖脱毒技术在脱毒成功率、脱毒植株基因完整性、脱毒苗后代的表现等方面都优于传统常规脱毒技术，剥离茎尖1.0～1.5 mm时，新技术脱毒成功率为83%，传统方法的脱毒成功率为50%左右，可见新方法在钝化病毒、提高脱毒成功率上有着重要作用(表1)。通过剥离不同茎尖大小，热处理后1.0～1.5 mm，传统方法0.2～0.5 mm，结果发现茎尖1.0～1.5 mm剥离茎尖后代变异率只有3.3%，而传统茎尖剥离变异率为33%，由此可见，由于草莓作物本身的特性，需要结合热处理剥离1.0～1.5 mm以上茎尖能有效保证品种特性(表2，图4,图5)。

表1 茎尖脱毒成功率比较

表2 脱毒植株基因完整性比较

图4 草莓脱毒组培苗

图5 草莓脱毒移栽苗

2.2 丹参二次剥离茎尖脱毒技术

丹参组培苗由于品种本身的原因玻璃化非常严重，直接用野外材料消毒进行茎尖脱毒，茎尖很容易直接玻璃化。与其他作物比如马铃薯、草莓等不同，丹参茎尖外没有叶片包裹，裸露的茎尖直接接触消毒液，很容易被消毒液伤害，剥离下来的茎尖成活率只有10%，而先用较大的茎尖或者叶片获得组培苗后再用无菌组培苗进行二次剥离，茎尖成活率85%以上(表3)，茎尖成活率增加7倍。

表3 不同剥离技术茎尖成活率比较

2.3 魔芋抗褐化茎尖脱毒技术

从表4可以看出，4种抗褐化药剂1%柠檬酸效果最佳，褐化率为20%，其次是0.3%活性炭、1%抗坏血酸、0.01% PVP，褐化指数也是柠檬酸最低，褐化指数越低，成苗速度越快。因此1%柠檬酸在魔芋茎尖脱毒抗褐化上有着明显效果。从表5可以看出，茎尖剥离过程全程浸泡在无菌1%柠檬酸溶液中，抗褐化效果有明显增加，抗褐化率降低4倍，为5%(图7,图8)。

表4 4种抗褐化药剂对魔芋茎尖抗褐化效果的影响(常规剥离)

图6 丹参脱毒组培苗

表5 2种不同茎尖剥离方法对茎尖抗褐化效果的影响

图7 魔芋脱毒组培苗

图8 魔芋脱毒组培生根苗

3 讨 论

植物茎尖脱毒技术在无性繁殖作物提纯复壮中效果明显，但是传统茎尖脱毒技术在某些作物脱毒后再生苗变异率高、茎尖玻璃化、茎尖褐化等存在技术缺陷。针对四川特色作物茎尖脱毒关键技术缺乏自主性和特色，行业标准不健全，虽然引进国外茎尖脱毒技术，但是没有结合四川省生产、生态特点和特色作物品种实际条件，很好地消化吸收利用和再创新，未能形成具有自主知识产权和适应四川特色作物的简化高效精准脱毒核心技术，脱毒繁育技术效率低、繁殖慢、数量少、成本高、推广难，急需解决。

在优良品种群体中，选择优良单株，放置在光照培养箱中进行长光照高温热处理培育一周，结合光温热处理使草莓茎尖在病毒钝化条件下茎尖顶部体积培育增大，茎尖剥离时尽量剥最大茎尖部分(1.0～1.5 mm)，比传统茎尖剥离方法长度增加两倍以上，脱毒后保证草莓优良品种典型的生物学特性，获得遗传基础一致的优良后代，提高草莓商品品质和效益[9]。

四川省中药材传统种植长期采用药农自留种，种性混杂退化严重，产量和品质都受到很大影响。由于采用传统方法培育的丹参组培苗玻璃化程度高，如果像其他作物一样直接选用野外材料进行茎尖脱毒，茎尖会直接玻璃化，不能获得有效脱毒植株，因此在丹参种苗繁育上应用脱毒技术必须首先解决茎尖玻璃化的难题。同时，在丹参茎尖脱毒技术规程和培养基配方等方面都需要结合特色作物生产实践探索创新。针对丹参茎尖玻璃化的难题，创新了丹参二次剥离茎尖脱毒新技术。其技术关键是：在丹参大田种植群体中选择壮苗优株，第一次进行芽尖(1～2 cm)剥离，开展离体培育获得无菌组培苗，再从中选择优良组培苗进行茎尖剥离(0.2～0.5 mm)脱毒，在专设培养基中开展组织培养，大量扩繁优质脱毒苗。新方法能有效获得脱毒植株，提高茎尖成活率，增加脱毒效果。

褐化是魔芋茎尖脱毒成活率低的主要问题，以前研究者对魔芋抗褐化做了大量研究[10]，但主要集中在常规抗褐化剂(活性炭、抗坏血酸、PVP等)上，剥离方法也是使用原有在空气中剥离，本实验使用了抗褐化剂1%柠檬酸并且将茎尖浸泡在1%柠檬酸溶液中进行剥离的新方法，能很好解决褐化问题。研究表明，柠檬酸在抗褐化上效果明显,这与柠檬酸本身的理化性质有关。