一测多评法同时测定木瓜中5种五环三萜类成分的含量Δ

张亭亭，胡浩宁，李平媛，黄永梅，汪鋆植#，唐海明，尹永红（1.三峡大学健康医学院，湖北 宜昌4400；.三峡大学生物与制药学院，湖北 宜昌 4400；.湖北恒安芙林药业股份有限公司，湖北宜昌4410）

木瓜为蔷薇科植物贴梗海棠Chaenomeles speciosa（Sweet）Nakai 的干燥近成熟果实，又名皱皮木瓜、铁脚梨，具有舒筋活络、和胃化湿之功效，可用于治疗湿痹拘挛、腰膝关节酸重疼痛、暑湿吐泻、转筋挛痛、脚气水肿，有“杏一益，梨二益，木瓜百益”之说[1]。木瓜主要含有黄酮类、有机酸类、三萜类、皂苷类、糖类、鞣质等成分，其中五环三萜类成分为其活性成分，包括齐墩果酸、熊果酸、3-O-乙酰坡模醇酸、白桦脂酸、3-O-乙酰熊果酸等成分，具有抗炎、保肝、抗肿瘤、抗病毒、抑菌、保护胃黏膜和降血脂等作用[2-3]。木瓜现收载于2020 年版《中国药典》（一部），仅以齐墩果酸和熊果酸为指标成分进行质量控制[4]。

一测多评（quantitative analysis of multi-components by single-marker，QAMS）法是一种利用中药有效成分的内在函数及比例关系来实现多指标质量控制的含量测定方法[5]，已被广泛用于中药材及其复方制剂的质量控制领域[6-7]。虽然已有学者采用QAMS 法，以齐墩果酸为内参物，但仅同时测定了木瓜中齐墩果酸、熊果酸的含量[8]。由于木瓜中五环三萜类成分复杂，仅对少数几个成分进行检测，无法充分反映药材的整体质量，且其中一些五环三萜类成分的对照品难以获得、价格昂贵，因此本研究拟采用QAMS 法同时测定木瓜中3-O-乙酰坡模醇酸、白桦脂酸、齐墩果酸、熊果酸、3-O-乙酰熊果酸5种五环三萜类成分的含量，旨在为木瓜药材的质量控制提供依据。

1 材料

1.1 主要仪器

本研究所用主要仪器有DIONEX Ultimate 3000 型高效液相色谱（HPLC）仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）、GZX-9240MBE 型鼓风干燥箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）、FA2004 型十万分之一分析天平（上海越平科学仪器有限公司）、KQ-400DB 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）等。

1.2 药品与试剂

齐墩果酸对照品（批号B20954）、熊果酸对照品（批号B21403）均购自上海源叶生物科技有限公司，纯度均不低于98%；白桦脂酸对照品（批号Wkq18030810）、3-O-乙酰熊果酸对照品（批号Wkq17112306）均购自四川省维克奇生物科技有限公司，纯度均不低于98%；3-O-乙酰坡模醇酸对照品由三峡大学天然产物研究与利用湖北省重点实验室制备，经HPLC面积归一化法检测其纯度≥98%；甲醇、乙腈均为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

木瓜药材采自湖北长阳、浙江淳安、安徽宣城、重庆黔江4个产地，经三峡大学生物与制药学院陈发菊教授鉴定为蔷薇科木瓜属植物贴梗海棠C.speciosa（Sweet）Nakai 的干燥近成熟果实。将同一产地样品分为两部分，一部分用鲜切工艺进行炮制（将木瓜对半纵剖，然后切薄片，于80 ℃烘干）；另一部分用传统工艺进行炮制（将木瓜对半纵剖，晒干，经润透或蒸透后切薄片，于80 ℃烘干），共得到8 批木瓜样品，其具体来源信息见表1。

表1 木瓜药材样品的来源信息

2 方法与结果

2.1 色谱条件

以COSMOSIL 5 C18-MS-Ⅱ（250 mm×4.6 mm，5 μm）为色谱柱，以乙腈-0.005 mol/L 磷酸氢二铵溶液（用磷酸调pH 至6.5）（70∶30，V/V）为流动相；流速为1.0 mL/min；柱温为30 ℃；检测波长为210 nm；进样量为20 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液 分别取3-O-乙酰坡模醇酸、白桦脂酸、齐墩果酸、熊果酸、3-O-乙酰熊果酸对照品约8、4、19、16、8 mg，精密称定，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，得混合对照品贮备液；精密量取该贮备液1 mL，加甲醇适量，制得上述各成分质量浓度分别为81.2、42.4、192.3、155.4、84.1 μg/mL 的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液 取药材样品粉末约1.0 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇30 mL，密塞，称定质量，超声（功率250 W，频率40 kHz）处理30 min，放冷，再次称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 系统适用性试验

取上述混合对照品溶液、供试品溶液（编号S1）、空白对照溶液（甲醇），按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，详见图1（空白对照溶液图略）。由图1可知，3-O-乙酰坡模醇酸等5 种成分的分离效果较好，分离度均大于1.5，空白对照溶液对测定无干扰。

图1 3-O-乙酰坡模醇酸等成分混合对照品溶液、供试品溶液的HPLC图

2.4 线性关系考察

取“2.2.1”项下混合对照品溶液适量，分别用甲醇稀释1、5、10、15、20倍，得系列线性溶液。取上述各线性溶液及混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以待测成分质量浓度为横坐标（X）、峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归，具体结果见表2。

表2 3-O-乙酰坡模醇酸等成分的回归方程和线性范围

2.5 精密度试验

精密吸取“2.2.2”项下供试品溶液（编号S1），按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，记录峰面积。结果显示，3-O-乙酰坡模醇酸、白桦脂酸、齐墩果酸、熊果酸、3-O-乙酰熊果酸峰面积的RSD 分别为2.65%、2.90%、1.00%、1.85%、0.49%（n＝6），表明方法精密度良好。

2.6 稳定性试验

取“2.2.2”项下供试品溶液（编号S1），分别于室温下放置0、2、4、6、8、10、12、24 h 时按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果显示，3-O-乙酰坡模醇酸、白桦脂酸、齐墩果酸、熊果酸、3-O-乙酰熊果酸峰面积的RSD分别为0.35%、2.71%、1.66%、0.90%、1.09%（n＝8），表明供试品溶液于室温下放置24 h内稳定性良好。

2.7 重复性试验

精密称取木瓜药材样品（编号S1）粉末1.0 g，共6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并按外标法计算样品含量。结果显示，3-O-乙酰坡模醇酸、白桦脂酸、齐墩果酸、熊果酸、3-O-乙酰熊果酸含量的RSD 分别为1.97%、2.86%、2.19%、0.94%、2.14%（n＝6），表明方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验

精密称取已知含量的木瓜药材样品（编号S1）粉末50 mg，共6 份，分别加入一定量的混合对照品溶液，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率。结果显示，3-O-乙酰坡模醇酸、白桦脂酸、齐墩果酸、熊果酸、3-O-乙酰熊果酸的平均加样回收率分别为100.47%、100.16%、98.29%、101.38%、98.40%，RSD 分别为0.90%、2.07%、0.41%、1.67%、1.56%（n＝6）。

2.9 QAMS法相对校正因子的确定

2.9.1 相对校正因子的计算 取“2.2.1”项下混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件分别进样1、2、5、10、20 μL，以齐墩果酸（含量较高且对照品易得）为内参物，按下式计算齐墩果酸相对于其他成分的相对校正因子（fsi）：fsi＝（As/Cs）/（Ai/Ci）（式中，As为内参物峰面积，Cs为内参物质量浓度，Ai为待测成分色谱峰峰面积，Ci为待测成分质量浓度[5]）。结果显示，3-O-乙酰坡模醇酸、白桦脂酸、熊果酸、3-O-乙酰熊果酸的平均相对校正因子分别为1.281、1.641、1.261、1.408，RSD 分 别 为2.090%、2.280%、1.250%、1.040%（n＝5），表明各成分相对校正因子的准确性较好。

2.9.2 耐用性考察 取“2.2.1”项下混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样，记录峰面积，考察不同色谱仪（DIONEX Ultimate 3000 型HPLC 仪、岛津LC-20A 型HPLC仪）、色谱柱[Ultimate XB Cl8、Cosmosil C18-MS-Ⅱ、SPOLAR C18（规格均为250 mm×4.6 mm，5 μm）]对相对校正因子的影响。结果显示，3-O-乙酰坡模醇酸、白桦脂酸、熊果酸、3-O-乙酰熊果酸的平均相对校正因子分别1.286、1.630、1.252、1.413，RSD 均小于3%（n＝5）,表明不同色谱仪及色谱柱对3-O-乙酰坡模醇酸等4种成分的相对校正因子无明显影响，该方法耐用性良好。

2.9.3 相对校正因子的确定 根据“2.9.2”项下结果，最终确定3-O-乙酰坡模醇酸、白桦脂酸、熊果酸、3-O-乙酰熊果酸的相对校正因子分别为1.286、1.630、1.252、1.413。

2.9.4 色谱峰的定位 取“2.2.1”项下混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，分别考察不同色谱仪（DIONEX Ultimate 3000 型HPLC 仪、岛津LC-20A 型HPLC仪）、色谱柱[Ultimate XB Cl8、Cosmosil C18-MS-Ⅱ、SPOLAR C18（规格均为250 mm×4.6 mm，5 μm）]对相对保留时间的影响。结果显示，3-O-乙酰坡模醇酸、白桦脂酸、熊果酸、3-O-乙酰熊果酸相对保留时间的RSD 均小于5%（n＝5），表明相对保留时间法可用于3-O-乙酰坡模醇酸等成分的初步定位。

2.10 样品含量测定

取8 批木瓜药材样品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，分别按外标法、QAMS法（以齐墩果酸为内参物）计算样品含量，采用相对偏差[相对偏差＝（QAMS法含量-外标法含量）/外标法含量×100%]考察2 种方法所得结果的差异。每样品平行测定3次，结果见表3。

表3 木瓜中3-O-乙酰坡模醇酸等成分的含量测定结果（n＝3，%）

由表3 可知，2 种方法所得含量测定结果的相对偏差均小于8%。同时，采用SPSS 22.0 软件对2 种方法所得含量结果进行t检验，结果显示，2 种方法所得结果组间比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），表明采用QAMS法同时测定木瓜中多种三萜类成分是可行的。

此外，本研究采用外标法比较了不同产地鲜切和传统工艺加工木瓜中齐墩果酸与熊果酸的总含量及5种成分的总含量，结果见表4。

表4 不同产地鲜切和传统工艺加工木瓜中部分成分的含量比较（±s，n＝3，%）

表4 不同产地鲜切和传统工艺加工木瓜中部分成分的含量比较（±s，n＝3，%）

a：与重庆黔江产木瓜比较，P＜0.05

产地湖北长阳浙江淳安安徽宣城重庆黔江齐墩果酸与熊果酸的总含量鲜切工艺0.680 5±0.013 9 0.583 5±0.006 6 0.639 5±0.005 9 0.528 0±0.008 3传统工艺0.636 5±0.012 4 0.537 5±0.015 9 0.609 5±0.005 9 0.518 5±0.005 9 5种成分的总含量鲜切工艺0.916 0±0.006 3a 1.061 0±0.047 9a 0.818 0±0.006 8a 1.306 5±0.035 5传统工艺0.829 0±0.007 5a 0.817 5±0.026 5a 0.770 5±0.021 0a 1.283 5±0.041 7

由表4 可知，不同木瓜样品中齐墩果酸与熊果酸的总含量均不低于0.5%，符合2020 年版《中国药典》（一部）的要求[4]。不同产地、不同炮制工艺木瓜样品中5种成分的总含量存在差异；而在同一产地的鲜切工艺加工木瓜中，2 种成分的总含量和5 种成分的总含量均高于传统工艺加工木瓜，平均升高5.62%、10.83%，其中重庆黔江产木瓜中5 种成分的总含量显著高于其他产地（P＜0.05）。

3 讨论

木瓜中的五环三萜类成分是其主要的活性成分[9-10]。本课题组前期比对了相关文献[11-12]，并在HPLC分析的基础上，最终选择了3-O-乙酰坡模醇酸、白桦脂酸、齐墩果酸、熊果酸、3-O-乙酰熊果酸作为木瓜药材质量评价的指标。

本课题组前期曾采用2020 年版《中国药典》（一部）“木瓜”项下齐墩果酸和熊果酸的色谱条件进行测定，但实践结果显示，各成分的分离度欠佳；随后，参照相关文献[13-14]，对色谱条件进行优化，最终确定了“2.1”项下色谱条件。系统适用性试验结果显示，各成分分离良好，此法可用于木瓜中多种五环三萜类成分的定量分析。

含量测定结果显示，QAMS法与外标法所得3-O-乙酰坡模醇酸、白桦脂酸、熊果酸、3-O-乙酰熊果酸含量的相对偏差均小于8%，表明2种方法所得含量结果无明显差异。不同产地鲜切和传统工艺加工木瓜中齐墩果酸与熊果酸的总含量均不低于0.5%，5种成分的总含量均不低于0.7%；在同一产地的鲜切工艺加工木瓜中，无论是齐墩果酸与熊果酸的总含量还是5种成分的总含量均高于传统工艺加工木瓜，其中齐墩果酸和熊果酸的总含量平均升高5.62%，5种成分的总含量平均升高10.83%。这表明不同产地、不同炮制工艺木瓜中5种成分含量存在差异，以多成分为指标进行质量分析较单一指标更为科学、合理。此外，木瓜鲜切片采用产地加工炮制一体化工艺，集中采收鲜果，一次性加工，中间环节明显减少且操作规范，有利于提高木瓜药材的质量。

综上所述，本研究建立了同时测定木瓜中3-O-乙酰坡模醇酸、白桦脂酸、齐墩果酸、熊果酸、3-O-乙酰熊果酸含量的QAMS法，该方法简便、快速、准确。重庆黔江产木瓜中5种成分的总含量较高，且同一产地鲜切工艺加工木瓜总含量高于传统工艺加工木瓜。