外周血微小RNA-221与急性脑梗死病情严重程度的相关性及对90 d预后的预测价值

李红叶，郭月萍

急性脑梗死是临床上常见的脑血管疾病，颅内动脉血栓形成或血栓栓塞引起脑组织缺血缺氧损伤是造成神经功能损害的直接原因，疾病的致残率较高、救治难度大。尽管近些年溶栓、介入等再灌注治疗手段发展迅速、急性脑梗死的治疗效果明显提高，但仍有部分患者无法获得良好的预后、遗留不同程度的神经功能缺损并影响日常生活[1]。目前的研究[2-4]认为，与急性脑梗死患者神经功能损害相关的环节包括炎症反应、氧化应激、内质网应激、细胞凋亡及自噬等。寻找参与上述环节的关键分子不仅有助于阐明急性脑梗死后神经损伤的分子机制，也有助于发现评估急性脑梗死病情及预后的分子指标。

微小RNA(miR)是近年来表观遗传学研究的热点，能够在转录后水平调控多种基因表达并参与炎症、氧化应激、凋亡等环节的调控。孙瑛等[5]的研究表明，大鼠缺血再灌的脑组织中miR-221表达减少，尾静脉注射miR-221激动剂能够减轻脑缺血再灌注损伤并抑制炎症反应、细胞凋亡，表明miR-221可能在急性脑梗死的发生发展过程中起保护作用。基于此，本研究将外周血miR-221表达用于急性脑梗死患者的病情评估，具体分析了外周血miR-221与急性脑梗死病情严重程度的相关性及对90 d预后的预测价值。

1 对象与方法

1.1 对象 选择2017年5月至2019年5月我院收治的108例急性脑梗死患者作为脑梗死组，入组标准：(1)符合急性脑梗死的诊断标准[6]；(2)发病时间≤72 h；(3)临床资料及随访资料完整。排除标准：(1)合并脑出血；(2)既往有脑梗死、脑出血、脑外伤病史；(3)合并恶性肿瘤、自身免疫性疾病。另取同期体检的120名健康者作为对照组。脑梗死组中男性67例，女性41例；年龄41～64岁，平均(52.18±10.24)岁；对照组中男性70人，女性50人；年龄40～60岁，平均(50.19±11.75)岁。两组间一般资料的比较差异无统计学意义(均P>0.05)。

1.2 方法

1.2.1 外周血miR-221表达的检测 采用北京博凌科为公司的试剂盒进行检测。脑梗死组患者入院后采集外周静脉血3 ml，对照组受试者体检时采用外周静脉血3 ml。采用全血miR提取试剂盒分离外周血中的miR。采用miRNA反转录试剂盒将外周血中的miR反转录为cDNA。采用miRNA荧光定量PCR检测试剂盒配置反应体系如下：cDNA样本1 μl、qPCR Mix 10 μl、10 μmol/L上下游引物各0.4 μl、去离子水补足至20 μl；在荧光定量PCR仪上按照二步法进行反应：94 ℃预变性2～3 min，94 ℃ 15 s、60 ℃ 40 s重复40个循环，生成循环曲线及循环阈值(Ct)，根据Ct值、以U6为内参，计算miR-221的表达水平。

1.2.2 脑梗死病情严重程度的评价 根据入院时NIHSS评分评价神经缺损程度，NIHSS评分0～15分为轻中度、≥16分为重度；根据入院后影像学检查所见梗死灶直径评价脑梗死面积，直径>4 cm为大面积梗死、≤4 cm为中小面积梗死。

1.2.3 90 d预后的评价 脑梗死组患者出院后90 d时进行门诊复诊，根据mRS评分评价患者的预后，mRS≤2分为预后良好、mRS>2分为预后不良。

1.2.4 预后相关因素的收集 根据脑梗死组患者的病历资料，收集以下信息：性别、年龄、高血压病、冠心病、糖尿病、心房颤动(房颤)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDLC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDLC)、随机血糖、同型半胱氨酸(Hcy)、超敏C反应蛋白(hs-CRP)、发病到入院时间、脑梗死直径。TC、LDLC、HDLC、随机血糖、Hcy、hs-CRP采用全自动生化分析仪测定，脑梗死直径根据影像学检查结果进行测量，其他资料根据病史进行判断。

2 结 果

2.1 脑梗死组与对照组外周血miR-221表达水平的比较 见表1。脑梗死组患者外周血miR-221的表达水平明显低于对照组(P<0.05)。

表1 脑梗死组与对照组外周血miR-221表达水平的比较

2.2 脑梗死组中不同病情严重程度患者外周血miR-221表达水平的比较 见表2、图1。与脑梗死组中轻中度神经功能缺损患者比较，重度神经功能缺损患者外周血miR-221的表达水平明显降低(P<0.05)；与脑梗死组中中小面积梗死患者比较，大面积梗死患者外周血miR-221的表达水平明显降低(P<0.05)。经Pearson检验，脑梗死组患者外周血miR-221的表达水平与NIHSS评分及梗死面积具有负相关关系，相关系数分别为-0.700和-0.718(均P<0.001)。

图1 脑梗死组患者外周血miR-221的表达水平与NIHSS评分及梗死面积的相关性

表2 脑梗死组中不同病情严重程度患者外周血miR-221表达水平的比较

2.3 脑梗死组中预后良好患者与预后不良患者外周血miR-221表达水平及临床特征的比较 见表3。根据90 d mRS评分，脑梗死组108例患者中共46例预后不良，发生率为42.59%。脑梗死组中预后良好患者与预后不良患者比较，性别、年龄、高血压病、冠心病、糖尿病、房颤、脑梗死直径、TC、LDLC、HDLC、随机血糖差异无统计学意义。与脑梗死组中预后良好患者比较，预后不良患者外周血miR-221的表达水平明显降低，入院时NIHSS评分、Hcy水平、hs-CRP水平明显升高，发病到入院时间明显延长，差异有统计学意义(均P<0.05)。

表3 脑梗死组中预后良好患者与预后不良患者miR-221及临床特征的比较[例(%)，±s]

表3 脑梗死组中预后良好患者与预后不良患者miR-221及临床特征的比较[例(%)，±s]

因素预后良好患者(n=62)预后不良患者(n=46)χ2/t值P值男性36(58.06)31(67.39)0.9750.323年龄(岁)51.39±10.0953.25±11.030.9100.365高血压病30(48.39)26(56.52)0.7000.403冠心病2(3.23)3(6.52)0.6500.420糖尿病15(24.19)14(30.43)0.6320.427房颤4(6.45)5(10.87)0.6750.411发病到入院时间(h)24.24±6.5132.19±7.855.746<0.001入院时NIHSS评分(分)4.77±0.938.18±1.8312.648<0.001脑梗死直径(cm)3.73±0.894.21±0.942.7060.008TC(mmol/L)4.39±0.924.67±1.041.4790.142LDLC(mmol/L)3.09±0.623.24±0.821.0830.281HDLC(mmol/L)1.15±0.311.04±0.371.6780.096随机血糖(mmol/L)7.14±1.218.03±1.553.3510.001Hcy(μmol/L)11.48±2.9516.05±3.417.447<0.001hs-CRP(mg/L)6.11±1.748.29±1.816.329<0.001miR-2210.75±0.250.51±0.175.616<0.001

2.4 脑梗死组患者预后不良影响因素的Logistics回归分析 见表4。以脑梗死组患者预后为应变量，以单因素分析有统计学差异的miR-221、入院时NIHSS评分、脑梗死直径、随机血糖、Hcy、hs-CRP、发病到入院时间作为自变量进行Logistics回归分析显示，miR-221、入院时NIHSS评分、脑梗死直径、Hcy是脑梗死组患者预后不良的影响因素(均P<0.05)。

表4 脑梗死组患者预后不良影响因素的logistics回归分析

2.5 外周血miR-221预测脑梗死组患者预后不良的ROC曲线分析 见图2。绘制外周血miR-221预测脑梗死组患者预后不良的ROC曲线，曲线下面积为0.7923(P<0.0001)。根据约登指数最大值确定miR-221预测脑梗死组患者预后不良的最佳截点为0.60，该最佳截点预测预后不良的灵敏度和特异性分别为67.74%和71.74%。

图2 外周血miR-221预测脑梗死组患者预后不良的ROC曲线

3 讨 论

miR-221是具有心脑血管保护作用的miR，国内孙瑛等[5]的实验研究已经证实miR-221在大鼠缺血再灌的脑组织中表达减少，使用miR-221激动剂能够减轻脑缺血再灌注损伤；Peng等[7]的研究证实缺血性脑卒中患者外周血miR-221的表达减少，并且在离体培养的内皮细胞中、miR-221能够增强内皮功能；Zhou等[8]的研究证实miR-221能够减轻心肌梗死大鼠的心肌损伤及重构。本研究对急性脑梗死患者外周血miR-221表达的分析结果与Peng等[7]的研究一致，即脑梗死组外周血miR-221的表达水平明显降低。结合miR-221在脑梗死及心肌梗死中的保护作用，本研究进一步分析了miR-221表达与脑梗死病情的关系，通过神经功能缺损程度及脑梗死面积判断病情严重程度并分析miR-221的差异可知，重度神经功能缺损、大面积梗死患者外周血miR-221的表达水平明显降低，表明miR-221表达越低、急性脑梗死患者的神经缺损越重且脑梗死面积越大，与miR-221在动物及细胞实验中介导的心脑血管保护作用吻合。心肌梗死相关的临床研究[9]表明，miR-221对心肌梗死患者的预后具有预测价值，而miR-221与脑梗死预后的关系尚不明确。根据目前的基础研究，miR-221的生物学作用包括抗炎、抗氧化、抗凋亡等。急性脑梗死的相关研究[10-12]表明，炎症反应、氧化应激、细胞凋亡是与神经功能损害密切相关的因素，神经功能损害的加剧会影响远期预后、使致残率增加。国内多项关于急性脑梗死患者预后的研究均以出院后90 d作为评估预后的时间点，有研究[13-15]结果显示，急性脑梗死患者90 d预后不良的发生率分别为36.48%、51.43%、41.41%。本研究也对急性脑梗死患者的90 d预后进行了评价，108例患者中共46例为预后不良，发生率为42.59%，与上述研究结果相似。进一步比较预后良好与预后不良患者入院时miR-221表达的差异可知，预后不良患者外周血中miR-221的表达水平明显低于预后良好患者，表明miR-221表达降低不仅与急性脑梗死的发生及病情的加重有关，还可能是造成90 d预后不良的因素之一。急性脑梗死患者的预后受到多因素、多环节的影响，miR-221表达减少可能通过调控炎症反应、氧化应激、细胞凋亡来影响预后，同时其他因素也可能影响预后。国内外多项关于急性脑梗死预后影响因素的研究[13-17]发现，入院时NIHSS评分增加、大面积脑梗死、中性粒细胞与淋巴细胞比值(NLR)增加、高Hcy血症是急性脑梗死预后不良的独立危险因素。本研究采用单因素分析及Logistic回归分析的方法对急性脑梗死预后不良的影响因素进行了探究，同时对急性脑梗死患者的临床特征及miR-221的表达水平进行了分析，结果显示，miR-221、入院时NIHSS评分、脑梗死直径、Hcy是脑梗死组患者预后不良的影响因素，入院时NIHSS评分、脑梗死直径、Hcy与预后不良相关的结果与既往国内外学者的研究吻合，miR-221与预后不良相关的结果与miR-221介导的心脑血管保护作用吻合。最后，本研究还通过ROC曲线分析发现入院时miR-221表达对预后不良具有预测价值，预测的最佳截点为0.60。

综上所述，外周血miR-221表达减少与急性脑梗死病情加重、90 d预后不良有关，miR-221表达对90 d预后具有预测价值，未来miR-221有望成为评价急性脑梗死病情及预后的标志分子，也有望作为急性脑梗死新的治疗靶点。