帕金森病患者血清激肽释放酶6、α突触核蛋白与疾病严重程度的相关性

朱洁楠，祖洁，徐传英，董丽果，张涛，周苏，崔桂云，张伟

帕金森病(PD)是一种中老年常见的CNS退行性疾病，其主要病理特征是中脑黑质多巴胺能神经元选择性缺失，残存的神经元内出现以α突触核蛋白(α-syn)异常聚集形成的路易小体[1-3]。研究[1]表明α-syn聚集、氧化应激、线粒体功能障碍、炎症、内质网应激和铁异常聚积等均可能参与PD多巴胺能神经元的变性死亡。通过抑制α-syn聚集或促进其降解对改善PD症状有效[4]。激肽释放酶6(klk6)有降解α-syn的作用，并与路易小体和胶质细胞质内含物等病理包涵体共定位[5]。klk6与体外α-syn的清除有关[6]。免疫组织化学和蛋白质印迹分析[7]显示，α-syn转基因小鼠及路易体痴呆患者皮质klk6水平显著降低。另有研究[6]指出，PD患者CSF中klk6降低，α-syn升高，呈负相关，然而也有研究[8]认为PD患者CSF中总α-syn降低，这种结论的矛盾性使其难以成为一种可靠的PD生物标记物。此外，在临床实践中CSF获取困难，不利于大规模应用，同时klk6在PD患者外周血中的研究鲜见报道。

因此，本研究通过研究PD患者血清α-syn、klk6与疾病严重程度之间的关系，以期寻求预测PD疾病严重程度的生物标志物，为疾病早期防治提供理论依据。

1 对象与方法

1.1 对象 选取2020年8月至2021年8月就诊于徐州医科大学附属医院的87例PD患者(PD组)，符合原发性PD的诊断标准[9]。满足以上诊断标准的患者需排除：(1)帕金森叠加综合征及继发性帕金森综合征；(2)合并其他神经系统疾病患者；(3)有颅脑外伤史者；(4)MMSE<24分；(5)心、脑血管疾病，肝、肾功能不全危及生命，不能配合者；(6)经过脑深部电刺激手术治疗。纳入同期就诊的42名健康体检者作为对照组(HC组)，HC组与PD组在性别、年龄、受教育年限、认知方面差异均无统计学意义(均P>0.05)(表1)。根据Hoehn-Yahr(H-Y)分期和病程评估患者疾病严重程度，其中H-Y分期<Ⅲ期为PD早期，≥Ⅲ期为PD中晚期。早期与中晚期PD患者在性别、年龄、受教育年限、认知方面差异均无统计学意义(均P>0.05)(表1)。本研究通过医院伦理委员会批准(XYFY2021-KL016-01)，获得研究对象同意，并签署知情同意书。

表1 所有受试者一般临床资料比较[例(%)，±s，M(Q25,Q75)]

表1 所有受试者一般临床资料比较[例(%)，±s，M(Q25,Q75)]

组别性别(男/女)年龄(岁)受教育年限(年)认知评分(MMSE)H-Y分期病程(年)HC组(n=42)20/2264.24±8.299.00 (7.50,12.00)26.88±1.42--PD组(n=87)42/4564.99±9.829.00 (0.00,12.00)26.38±1.323(2,3)7.00 (4.00,12.00)χ2/t/Z值0.0050.427-1.7201.972--P值0.9440.6700.0850.051--组别性别(男/女)年龄(岁)受教育年限(年)认知评分(MMSE)H-Y分期病程(年)早期PD(n=39)22/1764.28±7.989.00 (0.00,12.00)26.54±1.50 2(2,2.5)5.00 (3.00,8.00)中晚期PD(n=48)20/2865.56±11.148.50 (0.25,9.00)26.25±1.163(3,4)9.00 (5.25,13.75)χ2/t/Z值1.873-0.603-1.3480.985-8.213-3.733P值0.1710.5480.1780.328<0.001<0.001

1.2 方法

1.2.1 血清学检查 抽取两组受试者空腹静脉血各4 ml，4 ℃，5 000 r/min，离心10 min，收集血清置于-80 ℃冰箱备用。采用ELISA法测定klk6、总α-syn水平，试剂盒购自上海江莱生物科技有限公司，具体操作按试剂盒说明进行。

2 结 果

2.1 不同分组受试者血清klk6、α-syn水平的比较 见表2。PD组血清klk6、α-syn水平明显高于对照组(均P<0.05)，中晚期PD患者血清klk6、α-syn水平明显高于早期PD患者(均P<0.05)。

表2 不同分组受试者klk6、α-syn水平的比较(±s)

表2 不同分组受试者klk6、α-syn水平的比较(±s)

组别klk6α-synHC组(n=42)1.05±0.2021.25±4.28PD组(n=87)1.29±0.2226.79±4.14t值5.9877.042P值<0.001<0.001组别klk6α-syn早期PD(n=39)1.20±0.2125.05±4.07中晚期PD(n=48)1.36±0.2028.21±3.67t值-3.480-3.812P值<0.0010.002

2.2 血清klk6、α-syn水平与PD疾病严重程度的相关性分析 见图1、表3。Spearman相关性分析结果显示，PD 患者血清klk6、α-syn水平分别与H-Y分期、病程呈正相关(均P<0.05)。

图1 血清klk6、α-syn与H-Y分期、病程的相关性散点图

表3 血清α-syn、klk6水平与H-Y分期、病程的相关性

2.3 血清klk6、α-syn预测PD疾病严重程度的价值分析 见图2、表4。血清klk6预测PD疾病严重程度的ROC曲线下面积(AUC)为0.704(95%CI：0.597～0.797)，敏感度为66.7%，特异性为74.4%，约登指数为0.410。血清α-syn预测PD疾病严重程度的AUC为0.722(95%CI: 0.616～0.813)，敏感度为66.7%，特异性为69.2%，约登指数为0.359。二者联合预测PD疾病严重程度的AUC为0.774(95%CI: 0.672～0.857)，敏感度为68.7%，特异性为81.1%，约登指数为0.497。

图2 血清klk6、α-syn预测PD患者疾病严重程度的ROC曲线

表4 血清klk6、α-syn预测PD患者疾病严重程度的价值分析

3 讨 论

PD是第二大常见的中老年CNS退行性疾病，主要的病理学标志是黑质致密部多巴胺能神经元死亡和路易小体的形成。α-syn聚集、炎症、氧化应激增加、线粒体功能障碍、内质网应激和铁异常聚积等原因可能是引起PD黑质部位多巴胺能神经元变性的机制[1]。体内研究[10]表明，小鼠和果蝇神经元过度表达α-syn会出现类PD表现。研究[4,11]发现，PD患者皮肤、唇腺、肠道黏膜等部位α-syn水平均较对照组升高，且外源性α-syn可通过肌肉、胃内或静脉注射通过血-脑屏障到达CNS，同时可通过抑制α-syn聚集或促进其降解表示对改善PD症状有效。α-syn的异常聚集通过导致线粒体功能障碍、损伤蛋白酶体和溶酶体以及破坏内质网与高尔基体之间的运输发挥毒性作用。线粒体功能障碍也可导致α-syn聚集，α-syn聚集又进一步损伤线粒体形成正反馈，最终导致PD病情不断恶化。本研究中，PD患者血清α-syn水平较高，并与病程、H-Y分期呈正相关，与以上研究结论一致。尽管如此，刘涛等[12]研究并未发现PD患者血浆α-syn水平较对照组明显升高，同时梁杨等[13]研究指出PD患者外周血浆及红细胞中α-syn寡聚体含量有助于诊断，但不具备监测疾病进展价值，与本研究结论不一致。分析其原因，可能为研究纳入的样本量和PD人群不同有关。本研究入组PD患者样本量较大，并且中位病程为7年，较以上研究入组患者病情更重，因此α-syn水平更容易升高。

klk6是一种丝氨酸蛋白酶，在成人脊髓、脑干、大脑皮质、脉络丛和下丘脑中均有表达，与细胞外α-syn的清除有关[14]。klk6切割pro-MMP-2和pro-ADAMTS19以产生酶活性并以级联方式降解α-syn。研究[5]发现，klk6与PD患者路易体中的α-syn存在共定位。klk6主要位于线粒体内，当细胞被激活时，klk6从线粒体释放到细胞质中水解聚集的α-syn[5]。Spencer等[15]证实klk6过表达能够减轻野生型α-syn转基因小鼠的神经退行性缺陷。体外研究[5]表明，重组或天然分泌的klk6 能够切割细胞分泌的α-syn以及致病性α-syn纤维形式。当使用丝氨酸蛋白酶抑制剂和klk抑制剂时，α-syn在HEK-293细胞中的降解会降低，这种效应具有剂量依赖性[5]。既往有研究[6-7]显示klk6在PD患者CSF中水平降低，这与本研究发现其在血清中升高存在矛盾。在PD大鼠模型[16]中，提高体内klk6的水平可防止α-syn聚集和毒性。klk6在人神经母细胞瘤细胞中与α-syn部分共定位，呈独特的亚浆体分布，并证实klk6的下调导致内源性α-syn增加[16]。在路易体痴呆小鼠模型[6]中，慢病毒载体在脑内介导klk6表达减少，减低了细胞内α-syn的积累；在多系统萎缩小鼠模型[6]中，用表达klk6蛋白与ApoB融合的慢病毒载体外周给药，融合的klk6-ApoB可以穿过血-脑屏障，导致少突胶质细胞和星形胶质细胞中α-syn水平降低，并改善行为。且在DLB队列[16]中，扣带皮质中的klk6水平降低，并且与α-syn和α-syn-P129呈负相关。既往研究[17]显示，在AD患者不同脑区的提取物中，klk6 水平低于对照组，klk6 mRNA 水平在海马体也是如此。而在另一项研究[17]中，AD 患者血清中的 klk6 水平显着增加了 10 倍。在通过 CSF tau 水平表明细胞死亡后，klk6可能像许多其他蛋白质一样被稀释到CSF中，因此与神经元损伤有关[17]。klk6也在脉络丛、脑内血管和血-脑屏障本身的内皮细胞中表达。它靠近清除α-syn的血管周围空间，推测klk6可能通过血管周围引流减少淀粉样蛋白清除的免疫过程。综上，推测klk6为一种α-syn代谢调节剂。在本研究中，PD患者血清klk6水平较HC组明显升高，并与疾病严重程度呈正相关，这可能反映了一种对α-syn过度升高的代偿反应。

综上所述，PD患者血清klk6、α-syn水平升高，且与病程、H-Y分期呈正相关，推测α-syn升高为病理改变，而klk6升高可能是一种代偿反应，二者未来有望成为评价PD严重程度的生物指标。尽管如此，本研究仍有样本量不足且为单中心数据的缺点，存在选择偏倚可能，未来有必要进行更大样本量、多中心的临床研究对结果进行验证。