食欲素在细胞氧化应激中的神经保护作用及其机制研究*

李迎帅 曹 飞 王春梅 杨春青 刘 霞 王琴琴△

(1济宁医学院精神卫生学院，2济宁医学院康复医学院，济宁272000)

氧化应激参与帕金森病(Parkinson’s disease，PD)及阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)等神经退行性疾病的发生发展[1]。目前关于氧化应激在PD等神经退行性疾病中的调节机制尚不完全明确。转录因子Nrf2能调控下游抗氧化酶的表达，从而参与机体代谢及抗氧化等过程中，促进个体不断适应变化的环境[2-3]；Nrf2还参与AD及PD等多种神经退行性疾病的病理过程中[2]。

食欲素是一种神经肽，主要是由外侧下丘脑神经元分泌，包括食欲素A (Orexin A，OA)和食欲素B(Orexin B，OB)[4]。食欲素系统功能异常参与多种神经退行性疾病如AD及PD的发病过程中[5-7]。

本研究以H2O2诱导的HT-22细胞为体外氧化应激模型探讨食欲素在氧化应激过程中的作用，阐明食欲素在氧化应激中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1细胞 HT-22细胞系购自上海通派生物公司。培养至含有FBS(10%)的DMEM培养基中，在细胞恒温培养箱(5% CO2，37℃)中培养，待细胞长满，传代于六孔板中，用于后续实验。

1.1.2药品和试剂 OA及OB购自Phoenix Pharmaceuticals公司；DMEM购自HyClone公司；Nrf2抗体购自abclonal公司；β-actin抗体、羊抗鼠IgG及羊抗兔IgG购自ZSGB-BIO。

1.2 方法

1.2.1氧化应激细胞模型建立 HT-22细胞种于六孔板中，加入H2O2处理建立体外氧化应激模型。将细胞随机分为6组：对照组、H2O2组、OA组、OB组、H2O2+OA组及H2O2+OB组。待细胞长至40%～50%时，H2O2组给予H2O2(500μM·L-1)处理，OA组给予OA(10-7M·L-1)处理，OB组给予OB(10-7M·L-1)处理，H2O2+OA组及H2O2+OB组中给予H2O2(500μmol·L-1)+OA/OB(10-7M·L-1)处理，待处理24h后利用显微镜观察各组细胞状态及数量，并分别拍照，用于后续计数。

1.2.2qPCR检测各组Nrf2的表达 总RNA提取：待细胞处理完毕，吸除培养基并用PBS缓冲液清洗两遍后，加入一定量的裂解液RZ(TIANGEN公司)，待细胞充分裂解后，收集裂解液至EP管中(RNase-free)。按照总RNA提取试剂盒(TIANGEN公司)的说明书进行提取，将提取的RNA溶于适量的RNase-Free双蒸水中，待RNA充分溶解后，检测RNA的浓度。

反转录：根据说明书(TIANGEN公司)，取适量提取的总RNA(20μl的反应体系里加入50ng～2μg的RNA)置于EP管(RNase-free)，按稀释比例加入5×gDNA Buffer，加RNase-free的水补齐至20μl，充分混合均匀后置于42℃水浴锅中反应3min，结束后取出EP管置于冰上，按照相应的稀释比例加入10×King RT Buffer、FastKing RT Enzyme Mix及FQ-RT Primer Mix，加RNase-free的水补齐总体系10μl，充分混匀后加入到前面的gDNA步骤的反应体系中，混合均匀后置于42℃水浴锅中孵育15min，之后95℃孵育3min。反应结束后通过qPCR仪检测目的基因Nrf2的变化水平。Nrf2 qPCR引物如下：forward:5’-CGTCCCTAGGTCCTTGTTCC-3’;reverse:5’-TCAAATCCATGTCCTGCTGGG-3’。

1.2.3蛋白印迹检测各组Nrf2蛋白的表达 总蛋白提取:待细胞处理结束，将细胞内的培养基吸除干净，用PBS缓冲液清洗2遍后，然后将PBS吸干净，加入适量含有蛋白酶抑制剂的细胞裂解液RIPA裂解20～30min(将样品置于冰上进行操作)，待细胞充分裂解后，将裂解后的细胞转移到1.5ml EP管中。于12000g，4℃离心15min。将上清转移至新的EP管中，按比例加入适量蛋白上样缓冲液，放于100℃金属浴中加热10min，用于后续实验。

蛋白印迹：将提取的细胞蛋白样品，利用聚丙烯酰胺凝胶电泳方法将蛋白进行分离，之后通过转膜的方法将蛋白转移到PVDF膜上，加入1×TBST洗膜5min，然后加入5%的脱脂奶粉进行封闭1～2h，之后吸掉封闭液，加入稀释好的一抗，放于4℃摇床上，过夜孵育。第二天将一抗回收，加入1×TBST洗膜3次，每次10～15min，倒掉TBST，加入稀释好的二抗，然后放于室温孵育1h，之后回收二抗，加入1×TBST洗膜3次，每次10～15min，洗膜完毕后，之后将底物加入到PVDF膜上进行显色，用proteinsimple仪器采集数据，并使用ImageJ软件进行灰度分析。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 HT-22细胞氧化应激模型的建立

本研究利用H2O2诱导的HT-22细胞为模型，结果显示，与对照组相比，在处理24h的情况下，不同浓度的H2O2引起HT-22细胞数量不同程度地降低(图1)。其中500μM·L-1的H2O2处理24h能引起HT-22细胞数量降低50%左右。因此本研究后续均采用500μM·L-1H2O2处理的HT-22细胞作为细胞模型。

2.2 食欲素对HT-22细胞死亡的影响

与对照组相比，H2O2组HT-22细胞数量降低约50%，而与H2O2组相比，OA和OB显著增加HT-22细胞数量(约30%)，差异具有统计学意义(P<0.05)。因此，OA和OB显著降低H2O2引起的HT-22细胞死亡，说明OA和OB能显著降低H2O2对HT-22的神经损伤，进而发挥神经保护作用(图2)。

注：***P<0.001 vs.对照组；#P<0.05 vs.H2O2组； ##P<0.01 vs.H2O2组

2.3 H2O2对HT-22细胞中Nrf2基因表达水平的影响

qPCR结果显示，与对照组相比，H2O2组Nrf2基因表△△CT达约为-2.064，说明相对于对照组，H2O2显著升高HT-22细胞中Nrf2的基因表达水平。

2.4 食欲素对HT-22细胞中Nrf2蛋白表达水平的影响

相对于对照组，OA及OB对HT-22细胞中Nrf2的表达无显著影响，而OA和OB组HT-22细胞中Nrf2的蛋白表达水平约为H2O2组的2倍。说明相对于H2O2组，OA和OB显著升高HT-22细胞内Nrf2的蛋白表达水平(图3)，提示OA和OB很可能通过增强HT-22细胞中Nrf2的表达水平，进而发挥神经保护作用。

注：NS (P>0.05) vs.对照组；*P<0.05 vs.H2O2组

3 讨论

氧自由基的聚集会造成细胞内蛋白质及DNA等的损伤，进而引起组织及器官的功能异常，从而导致机体疾病的产生和发展[8-9]。氧化应激参与多种神经系统的发生过程中[1]。已有研究显示，食欲素参与到多种氧化应激相关神经退行性疾病的病理过程中[1]，然而其在氧化应激中的具体作用机制尚不明确。本研究利用体外H2O2诱导的HT-22细胞的氧化应激模型发现，H2O2显著降低HT-22细胞的数量，OA及OB能显著降低H2O2诱导的HT-22细胞的死亡，进而在细胞氧化应激模型中发挥神经保护作用。

H2O2可引起细胞成分破坏，引起氧化应激，导致细胞死亡[10]。H2O2是用来建立氧化应激模型的常用药物，有研究者发现600μM·L-1的H2O2处理24h能引起HT-22细胞数量降低50%左右[10]。这在一定程度上和本研究的实验结果是一致的。Nrf2属于碱性亮氨酸拉链(bZIP)转录因子家族成员[2]，参与氧化应激过程中，并在HT-22细胞的氧化应激模型中发挥一定的作用[11-12]。本研究中，与对照组相比，H2O2处理会引起HT-22细胞数量的显著下降，说明H2O2对HT-22细胞有一定的神经毒性；与H2O2组相比，OA及OB处理均能显著增加HT-22细胞的数量，说明OA及OB能够减轻H2O2的神经毒性作用；与对照组相比，H2O2显著增加HT-22细胞中Nrf2的基因表达水平，提示Nrf2在H2O2诱导的氧化应激中的潜在作用；与H2O2组相比，OA和OB显著增加HT-22细胞内的Nrf2蛋白的表达水平。一方面提示OA及OB对Nrf2表达水平的调控作用，另一方面本研究也提示食欲素系统与Nrf2信号通路的相关性。

前期研究显示，OA能显著降低氧化应激引起的SH-SY5Y细胞损伤[13]，这也进一步支持本研究的结论。本研究提示，Nrf2很有可能参与到食欲素介导的神经保护作用。正常生理条件下，Keap1会与Nrf2结合引起Nrf2进入降解途径，当外界条件改变如某些氧化应激相关刺激等存在时，会引起Nrf2从复合物中分离出来，进而入核，Nrf2入核之后会引起一些抗氧化酶等的产生，从而发挥抗氧化过程[2]。本文结果显示，H2O2显著增加HT-22细胞中的核因子Nrf2的基因表达水平，但是H2O2对HT-22细胞内Nrf2蛋白表达的影响需要进一步探究；而食欲素显著增强HT-22细胞内Nrf2蛋白的表达，因此我们推测食欲素很有可能是通过增强HT-22细胞内Nrf2的表达及入核，进而引起抗氧化应激相关因子的产生，从而降低H2O2引起的HT-22细胞的死亡[2]。而Nrf2在其中的具体作用机制需要进一步采用动物实验和细胞实验去阐释。

综上，本课题研究结果显示食欲素能增强H2O2引起的HT-22细胞的Nrf2的表达水平，并降低H2O2引起的HT-22细胞的神经损伤，发挥神经保护作用。而关于食欲素对Nrf2的具体调控机制还需要进一步探究。

利益冲突：所有作者均申明不存在利益冲突。