一株雏鹅星状病毒分离鉴定及其致病性分析

2022-10-28刘春朋欧溢泉郑钊武钟雅静马婷婷王宝东魏文康

东北农业大学学报 2022年8期

刘春朋，王萱，欧溢泉，郑钊武，钟雅静，马婷婷，王宝东，付晶，魏文康

（1.仲恺农业工程学院动物科技学院，广州 510225；2.广东省农业科学院农业生物基因研究中心，广州 510640；3.辽宁省农业发展服务中心，沈阳 110032）

近年来，鹅养殖数量快速增加，雏鹅痛风与星状病毒相关性研究报道日益增多。星状病毒属星状病毒科，是一种非包膜RNA病毒，依据其基因型可划分为两类，分别是哺乳动物星状病毒属和禽星状病毒属[1-2]，哺乳动物星状病毒属主要感染人、牛和羊等，腹泻是其主要症状之一；禽星状病毒属包括3个种，分别为禽类1～3型星状病毒（AAstV1～AAstV3），其中，AAstV1含有火鸡1型星状病毒；AAstV2含有禽1型肾炎病毒和禽2型肾炎病毒；AAstV3含有火鸡2型星状病毒和鸭1型星状病毒。部分报道的禽星状病毒株仍未见分类。Donato等依据现有分类原则和标准，将未经分类的禽星状病毒分为4个种，分别命名为AAstV4～AAstV7。其中，AAstV4包含鸡星状病毒等；AAstV5包含鹤肾炎病毒等；AAstV6包含斑鸠鹤星状病毒等；AAstV7包含野鹤星状病毒等[3]。鸭星状病毒于1965年在英国被首次报道，是禽星状病毒属中最早被发现的病毒，随后有科学家通过电子显微镜技术鉴定出一株鸭星状病毒[4]。2009年，我国某发病鸭厂首次分离得到鸭星状病毒[5]。2017年2月，山东、安徽和辽宁等地均爆发鹅星状病毒传染病，主要感染对象为2周龄以内雏鹅。临床解剖发现，大部分病鹅内脏器官表面及关节腔内附着大量尿酸盐沉积，伴随肾脏肿大发白以及脾脏肿大等病理症状，发病率高达90%，死亡率达50%，对养鹅业造成巨大冲击[6-7]。孙敏华认为鹅星状病毒是引起雏鹅痛风病主要致病病原，自制疫苗免疫存在免疫无效或低效防治情况[8]。为进一步了解不同地区星状病毒毒株之间遗传关系，本研究对广东清远金羽丰国家保种鹅场引发雏鹅痛风病原进行分离、鉴定及致病性分析，为雏鹅痛风病防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 临床样本和实验动物来源

临床样品痛风雏鹅由广东清远金羽丰国家保种鹅场提供，雏鹅解剖后可见脾脏肿大，肾脏肿大且发白，肝脏表面有尿酸盐沉积。采集尿酸盐沉积明显的心脏、肝脏、肾脏和脾脏组织，一部分固定于福尔马林溶液中用于组织病理学观察，一部分于-80℃超低温冰箱保存，用于PCR鉴定。10日龄健康狮头鹅鹅胚和1日龄健康雏鹅均由广东省清远金羽丰鹅业有限公司提供。

1.2 主要试剂耗材

Viral RNA Kit试剂盒（购自美国OMEGA试剂有限公司），PrimeScript RT Master Mix（购自宝日医生物技术有限公司），DNA Marker（购自天根生化科技有限公司），2×TaqPCR StarMix（购自北京康润诚业生物科技有限公司），核酸染料、无酶离心管、50×TAE溶液（购自白鲨生物科技-上海桥星贸易有限公司）。

1.3 主要仪器

生化培养箱、低温高速离心机和PCR仪（购自杭州博日生物科技有限公司），电泳仪和组织打磨器（购自德国IKA-WEREGMBH&Co.KG公司），紫外凝胶成像系统（购自上海天能生命科学有限公司），-80℃超低温冰箱（购自赛默飞世尔科技公司）。

1.4 病料采集及处理

等量选取病料肝脏、肾脏和脾脏，合计2 g，加无菌PBS溶液研磨制成20%匀浆，匀浆经5 000 r·min-1离心10 min后将其置于-80℃超低温冰箱冷冻20 min，随后立即解冻，反复冻融3次，最后将上清液置于-80℃超低温冰箱保存待用。

固定于福尔马林溶液中的内脏器官（心脏、肝脏、肾脏和脾脏），经脱水、透明、包埋、切片等处理后，采用苏木素伊红染色法（HE）对其染色，显微镜下观察组织病理变化情况。

1.5 痛风雏鹅中病原确定

1.5.1 引物设计与合成

针对我国鹅群常见病毒性传染病，检测痛风雏鹅中可能存在的常见病原鹅星状病毒（GAstV）、鹅呼肠孤病毒（GRV）、鹅腺病毒（EDS），根据文献报道设计相关特异性引物[9-11]（见表1），送上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

表1 引物序列Table 1 Primers sequences

1.5.2 病毒核酸提取

参考文献[12]方法提取病料中病毒核酸，利用TaKaRa反转录试剂盒制备cDNA，于-20℃冰箱保存。

1.5.3 常见病原PCR扩增和序列分析

参照文献[13]方法，对痛风雏鹅中可能存在常见病原进行PCR扩增，将星状病毒PCR阳性产物进行双向测序。测序结果上传至GenBank，通过BLAST功能进行序列同源性比对。

1.6 痛风雏鹅病原分离鉴定

将1.4制备获得的匀浆经0.22μm滤器过滤，并进行梯度稀释，稀释液终末浓度为匀浆浓度的100、10-1、10-2和10-3，该稀释液作为攻毒的病毒原液。病毒原液通过绒毛尿囊腔途径接种于10日龄鹅胚(每个浓度接种6个鹅胚)，每个鹅胚接种0.2 mL，将接种后鹅胚放置于37℃孵化箱培养。每日观察鹅胚生理状态，记录接种24 h内死胚数量。接种96 h后，无菌条件下收集鹅胚，观察胚体是否发生病变，将胚体参考1.4中方法制备上清液，接种到新鹅胚中，观察鹅胚病理变化、活力及死亡情况。检测鹅胚中病原并对其进行序列分析。

1.7 动物回归试验

将24只2日龄体重相近、健康雏鹅随机分为对照组和攻毒组，1.6中10-2组尿囊液和10-1组胚液按照2∶1混合作为攻毒原液。对照组肌肉注射2 mL生理盐水；攻毒1组肌肉注射0.5 mL攻毒原液+1.5 mL生理盐水；攻毒2组肌肉注射1.0 mL攻毒原液+1.0 mL生理盐水；攻毒3组肌肉注射1.5 mL攻毒原液+0.5 mL生理盐水，分组前检测雏鹅健康性，确保未携带星状病毒。于雏鹅4日龄时进行攻毒，攻毒后第2、4、6天采集雏鹅泄殖腔拭子，检测排毒情况。每日观察雏鹅生理状态并称重。发现死亡雏鹅立即剖检，观察其内脏器官病理变化，采集尿酸盐沉积严重的肝脏、肾脏和脾脏，一部分固定于福尔马林溶液中用于组织病理学观察，一部分保存于-80℃超低温冰箱用于星状病毒PCR鉴定。

2 结果与分析

2.1 痛风雏鹅中病原确定

2.1.1 痛风雏鹅剖检

临床剖检时发现痛风雏鹅心脏表面有尿酸盐沉积，肝脏表面有明显尿酸盐沉积，肾脏发白肿大呈现明显的“花斑肾”示病症状、脾脏肿大且有少量出血斑（见图1）。

图1 痛风雏鹅剖检Fig.1 Clinical autopsy in gout goslings

2.1.2 痛风雏鹅组织病理学观察

对采集的痛风雏鹅内脏器官HE染色后进行组织病理学观察。发现尿酸盐沉积明显的器官如肾脏、脾脏、心脏和肝脏均发生不同程度病变损伤，如图2所示。肾脏切片观察可见肾间质增生，肾小球界限不明显，肾小管中有炎性细胞（见图A1、A2）；肝脏组织中肝索结构不清，血管周围有炎症反应灶，且伴有大量胞浆中带红染颗粒的异嗜性粒细胞浸润（见图B1、B2）；脾脏组织有少量尿酸盐结节（HE染色为粉红色），在脾脏实质细胞间有大量红染颗粒的异嗜性粒细胞浸润（见图C1、C2）；心脏组织中心肌纤维排列紊乱，肿胀，可见少量炎性细胞（见图D1、D2）。由此可见雏鹅痛风病原可危害肾脏、肝脏、脾脏等主要代谢、解毒和免疫器官，与前人研究结果相同[14]。

图2 痛风雏鹅组织病理学观察Fig.2 Pathological observation in gout goslings tissues

2.1.3 痛风雏鹅常见病原检查结果

如图3所示，在痛风雏鹅中仅扩增出与星状病毒GAstV预期长度一致条带，其余病毒均未扩增出预期条带。将星状病毒PCR阳性产物送至上海生工生物工程有限公司测序，将测序结果在GenBank上通过BLAST进行序列同源性比对，结果显示PCR扩增的星状病毒基因序列片段长度为492 bp，与Gen-Bank中报道鹅源性GAstV基因序列（MT150877.1）同源性高达99.80%。

图3 痛风雏鹅病原鉴定Fig.3 Pathogen identification in gout goslings

2.2 痛风雏鹅病原分离鉴定

2.2.1 鹅胚剖检结果

将2.1.3中检测出星状病毒阳性样本加入PBS溶液制成20%浓度匀浆经离心收集上清液作为病毒原液，以绒毛尿囊腔途径接种鹅胚，连续传至第2代后，鹅胚未发生死亡，但出现明显病理变化，如图4所示，胚体表面和脏器均出现明显出血点，肾脏肿大、水肿，绒毛膜尿囊膜增厚等现象。

图4 攻毒鹅胚病理变化Fig.4 Pathological changes of virus inoculation goose embryo

2.2.2 鹅胚病原检测

将病毒接种两代后鹅胚全部处死（去除胚头）加无菌PBS溶液制成浓度为20%匀浆。对得到的匀浆液进行星状病毒（每组随机取2个鹅胚）定性检测。如图5所示，10-1和10-2组鹅胚尿囊液和胚液均检测到星状病毒，且胚液病毒含量高于尿囊液。因此，选取10-2组尿囊液和10-1组胚液混合液作为动物回归试验的攻毒原液。

将图5中星状病毒PCR扩增阳性产物送至上海生工生物工程有限公司测序。测序结果在GenBank上通过BLAST进行序列同源性比对，结果显示，各组鹅胚中星状病毒基因序列片段长度为462 bp，与GenBank中报道鹅源性GAstV基因序列（MT150877.1）同源性高达99.34%。初步证实该病毒分离株为星状病毒，命名为GDTF。

图5 攻毒鹅胚星状病毒随机检测结果Fig.5 Random test PCR results of virus inoculation goose embryo for GAstV gene

2.2.3 鹅胚病原序列分析

如图6所示，本试验分离得到的鹅源性星状病毒序列（GDTF）与Zhang等报道我国中部地区引起痛风症状的鹅星状病毒毒株（MW592379）聚成一个分支，说明二者遗传距离最近，与其他病毒遗传距离较远[15]。由此可见，导致该场雏鹅痛风的星状病毒是鹅源性星状病毒。

图6 GDTF与其他有关雏鹅痛风毒株系统进化树Fig.6 Phylogenetic tree of GDTF and other related gosling gout strains

2.3 动物回归试验

2.3.1 雏鹅健康性检测结果

攻毒前，对雏鹅进行鹅星状病毒定性检测，确保雏鹅无星状病毒污染。如图7所示，各组雏鹅泄殖腔拭子样品中未见鹅星状病扩增条带出现，即雏鹅均未携带鹅星状病毒。

图7 健康雏鹅星状病毒PCR检测Fig.7 Astrovirus PCR detection in healthy goslings

2.3.2 鹅星状病毒攻毒雏鹅结果

试验期间，对照组雏鹅并未出现死亡或发病迹象，因此肌肉注射2 mL溶液对雏鹅健康无明显影响；攻毒1组在攻毒第8天出现示病症状，表现为关节肿大、消瘦、食欲不振、羽毛黯淡无光、精神萎靡、排出灰白色粪便等，如图8所示；攻毒2组在攻毒第5天，出现发病死亡雏鹅；攻毒3组雏鹅在试验期间未出现死亡或示病症状；攻毒组与对照组雏鹅日增重均差异不显著。上述结果说明鹅星状病毒对雏鹅有致病性。18只攻毒雏鹅中有2只死亡（攻毒2组），死亡率11.11%。

图8 发病雏鹅示病症状Fig.8 Symptoms of diseased goslings

2.3.3 鹅星状病毒攻毒雏鹅解剖结果

剖检2.3.2中死亡雏鹅发现，内脏器官有广泛尿酸盐浸润（心脏、肝脏、脾脏），肾脏肿大呈明显“花斑肾”，肠道、肌肉等非实质性组织出现尿酸盐沉积（见图9）。未死亡雏鹅虽无示病症状，但肾肿大，呈“花斑肾”变化。如图10所示，攻毒雏鹅心脏被沉积的尿酸盐包裹（见图10A），肝脏表面也有尿酸盐沉积（见图10B），胆囊表面有少量尿酸盐附着（见图10C），肾脏肿大（见图10D），脾脏肿大有白色坏死点（见图10E），肌胃被尿酸盐大面积附着（见图10F）。在攻毒组中随机抽取4只雏鹅采样，参照1.5.3中方法进行鹅星状病毒定性检测，检测结果见图11。

图9 鹅星状病毒攻毒雏鹅解剖结果Fig.9 Anatomical results of gosling infected with goose astrovirus

图10 攻毒雏鹅各脏器病变Fig.10 Diseases of various organs in virus inoculation goslings

图11 攻毒组雏鹅星状病毒检测结果Fig.11 Results of goslings in the virus inoculation group(GAstV)

将本次检测出星状病毒PCR阳性产物送至上海生工生物工程有限公司测序，测序结果显示本次攻毒病死雏鹅星状病毒基因序列片段长度为462 bp，与报道鹅GAstV基因序列（MT150877.1）同源性高达98.91%，与鹅场采集病料中鹅星状病毒基因序列也存在高度同源。

2.3.4 鹅星状病毒攻毒后雏鹅组织病理学观察

将2.3.3中病变严重脏器进行HE染色。从图12中可观察到雏鹅肾脏、脾脏及肝脏均出现病变，如淋巴细胞以及巨噬细胞等炎性细胞浸润，肾脏还可观察到多核巨噬细胞，与2.1.2从养殖场取得病料组织病理变化相似。

图12 雏鹅攻毒后肾脏、肝脏和脾脏组织病理学变化Fig.12 Histopathological changes in kidney,spleen and liver of experimentally infected goslings

3 讨论

王安平等研究结果表明，病毒感染是导致雏鹅痛风最主要因素[16]。本试验采集具有典型痛风症状雏鹅病料，从中分离鉴定得到1株鹅星状病毒，命名为GDTF。系统进化树分析表明，该病毒分离株与Zhang等[15]报道我国中部地区流行鹅星状病毒毒株（MW592379）遗传距离较近。因此，我国中部和南部地区发生、流行的雏鹅痛风可能是由同一型星状病毒感染引起，且该星状病毒已大范围传播。

雏鹅痛风对鹅养殖业危害较大，4～16日龄雏鹅是主要感染对象，日龄越小，发病率和死亡率越高。该病以关节肿胀，心脏、肝脏和肾脏等实质性器官出现尿酸盐沉积为典型症状[17-18]。本研究攻毒雏鹅剖检时也可见内脏器官有大量尿酸盐沉积。目前，普遍认为肾脏是鹅星状病毒的主要靶器官[19]，推测可能是因肾脏排泄功能障碍，导致全身性尿酸盐沉积。从收集的病料和攻毒雏鹅的病理切片观察发现，肾脏、肝脏、脾脏、心脏等器官均发生不同程度炎症反应。说明鹅星状病毒对雏鹅具有广泛组织嗜性，引起器官炎症反应，导致雏鹅死亡[19]。

付新亮等指出，鹅星状病毒接种鹅胚后导致鹅胚100%死亡，接种后雏鹅死亡率达23%[20]。本研究将分离病毒株接种鹅胚后并未死亡，但出现明显病理变化。将分离病毒株接种于雏鹅，雏鹅死亡率为11.11%，说明该病毒分离株可通过鹅胚传染至雏鹅，且具有较强致病性。本研究鹅胚与雏鹅死亡率与其他文献报道有所区别，可能因病毒剂量、攻毒方法、雏鹅品种以及健康情况等因素存在一定差异。

星状病毒在我国分布地域广泛且宿主范围广[21-22]，近年来，雏鹅痛风发病率持续升高，给我国肉鹅养殖业造成巨大经济损失[23-24]。当前，生产中常用“肾肿解毒”类药物促进尿酸排出，短暂缓解症状，但对发病中后期，尤其是当全群发病、出现死亡病例时，药物治疗效果较差[23]。目前关于雏鹅痛风致病机理尚不明确，缺乏有效商品化疫苗，雏鹅痛风防控存在难度。加强雏鹅饲养管理、做好生物安全工作，仍是防控鹅痛风重要措施。鹅星状病毒致病机制研究和疫苗开发也是鹅病防控研究工作重点。