氨茶碱对慢性阻塞性肺疾病大鼠气道重塑的影响

杜文秀，张 欣，刘 芳，杜俊凤，张 颖，迟玉敏

沧州市中心医院呼吸科，沧州 061000

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)的主要病理特点为气道反复炎症、气流阻塞和气道重塑，其中气道重塑是导致气流受限的机制之一，而气道炎症所致气道重塑为COPD发展的关键因素[1]。转换生长因子β1(trandforming growth factorβ1，TGF-β1)/Smads通路是与COPD气道慢性炎症、气道重塑最相关的信号通路[2]。TGF-β1是前炎症因子，有极强的致纤维化作用，在炎症损伤、气道重塑中扮演了重要角色；Smad2为其下游受体激酶，为TGF-β1信号输出的关键信号转导子[3]。氨茶碱为临床常用的支气管扩张剂，有解痉、抗炎、调节免疫等作用[4]。故本研究基于TGF-β1/Smads通路，探讨氨茶碱对COPD大鼠症状的改善及对气道重塑的影响，为氨茶碱临床治疗COPD提供更多理论依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

RSE3020动物肺功能仪器(北京贝兰博科技有限公司)；Smart view凝胶图像分析系统(美国Major Science公司)；Imge-pro plus 5.0医学图像分析软件(上海元奥仪器有限公司)。

1.2 试药

红族渠香烟(焦油13 mg，尼古丁1.1 mg，河南安阳卷烟厂)；脂多糖(美国Sigma公司)；氨茶碱片(浙江瑞新药业股份有限公司，规格0.1 g·片-1，国药准字H33021127)；TGF-β1/Smads通路激动剂SRI-011381(质量分数98.0%，美国Abmole Bioscience公司)。白细胞介素-8(interleukin-8，IL-8)，IL-1β、基质金属蛋白酶组织抑制剂1(tissue inhibitor of metalloproteinase 1，TIMP-1)，基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)，ELISA试剂盒(上海臻科生物科技有限公司)，兔抗大鼠核因子-κB(nuclear factor kappa B, NF-κB)，磷酸化 NF-κB(p-NF-κB)，TGF-β1，Smad2，p-Smad2，GAPDH一抗(北京百奥莱博科技有限公司)，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG二抗(上海古朵生物科技有限公司)。

1.3 实验动物

SPF级雄性SD大鼠，55只，7周龄，体质量260～270 g，购自北京斯贝福生物技术有限公司，生产许可证号SCXK(京)2019-0010。排除呼吸系统疾病，实验前适应性饲养1 周。本实验符合动物伦理学原则。

2 方法

2.1 造模、分组和干预

随机取45只大鼠建立COPD模型[5]：自制45 cm×55 cm×60 cm熏箱，将大鼠置于其中，点燃香烟10 根，烟熏15 min，散烟5 min，上述步骤重复2次。每日烟熏1次，连续干预1个月。烟熏实验第1天、第15天，麻醉大鼠后快速注入100 μL脂多糖(1 mg·mL-1)至气管。共40只造模成功。随机分为激动剂组、模型组、激动剂+氨茶碱组、氨茶碱组，每组各10只。剩余10只大鼠作为正常组，在造模第1天、第15天注入等体积生理盐水。

烟熏30 d后给药：激动剂组灌胃SRI-011381溶液(以DMSO配制成质量浓度为30 mg·mL-1的溶液)，激动剂+氨茶碱组灌胃质量浓度为30 mg·mL-1的SRI-011381溶液和质量浓度为24 mg·mL-1氨茶碱溶液(氨茶碱片研制成粉末，以生理盐水配制成质量浓度为24 mg·mL-1的溶液)，氨茶碱组灌胃质量浓度为24 mg·mL-1的氨茶碱溶液，模型组、正常组灌胃等体积生理盐水，均按1 g体质量灌胃0.01 mL计算。每日1次，连续干预30 d。

2.2 测定大鼠肺功能

干预结束当天，用戊巴比妥钠麻醉大鼠，仰卧位固定在操作台上，在颈部取纵形2 cm长切口，充分暴露气管，在环状软骨上取“T”形切口，气管插管。切开大鼠左胸，迅速将胸腔插管与动物肺功能仪器压力传感器连接后插入胸膜腔。MedLab生物信号采集系统分析肺功能潮气量(tidal volume，VT)、呼气峰流速(peak expiratory flow，PEF)。

2.3 ELISA检测大鼠有关指标水平

ELISA检测大鼠血清IL-8、IL-1β和气道平滑肌中TIMP-1、MMP-9水平。取腹主动脉血6 mL，离心取上清，-20 ℃冻存待检。取血后处死，剥离大鼠气道平滑肌组织制备成匀浆，离心取上清。参考IL-8、IL-1β、TIMP-1、MMP-9 ELISA试剂盒说明书进行：在酶标包被板上设置对照孔、样品孔、标准品孔，上样，温育，洗涤，加酶标试剂，显色，终止。在450 nm波长下检测各孔吸光度值，计算各样本质量浓度。

2.4 观察大鼠肺部病理改变及测量支气管平滑肌厚度

处死大鼠后，右心室注射肝素，生理盐水冲洗肺组织，直至颜色洁白，将右肺中叶用体积分数为4%多聚甲醛固定，另一部分肺组织液氮冷冻。梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，制成4 μm薄片，进行HE染色，镜下观察肺部病理学改变。随机选取每只大鼠HE染色切片下相对完整的3个小气道进行图像分析测量，测量支气管平滑肌厚度。

2.5 检测大鼠TGF-β1/Smads通路蛋白表达

取出液氮冷冻的肺组织，裂解后制备匀浆，离心取上清。Bradford法检测蛋白质量浓度，取20 μg总蛋白上样，用10% SDS-PAGE凝胶进行电泳，分离目标蛋白至PVDF膜上，用质量浓度为0.5 g·L-1脱脂奶粉封闭2 h。加兔抗大鼠NF-κB、p-NF-κB、TGF-β1、Smad2(1∶1 000)、p-Smad2(1∶1 000)、GAPDH(1∶1 000)一抗，4 ℃孵育过夜。次日加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG二抗(1∶2 000)，室温孵育2 h，ECL发光显影，Image J图像分析软件检测条带灰度值。

2.6 统计学方法

3 结果

3.1 大鼠肺功能

与正常组比较，激动剂组、模型组、激动剂+氨茶碱组、氨茶碱组的VT、PEF水平较低(P<0.05)；与激动剂组比较，模型组、激动剂+氨茶碱组、氨茶碱组的VT、PEF水平较高(P<0.05)；与模型组比较，激动剂+氨茶碱组、氨茶碱组的VT、PEF水平较高(P<0.05)；与激动剂+氨茶碱组比较，氨茶碱组的VT、PEF水平较高(P<0.05)。见表1。

表1 大鼠肺功能指标

3.2 大鼠血清IL-8、IL-1β水平

与正常组比较，激动剂组、模型组、激动剂+氨茶碱组、氨茶碱组血清IL-8、IL-1β水平较高(P<0.05)；与激动剂组比较，模型组、激动剂+氨茶碱组、氨茶碱组血清IL-8、IL-1β水平较低(P<0.05)；与模型组比较，激动剂+氨茶碱组、氨茶碱组血清IL-8、IL-1β水平较低(P<0.05)；与激动剂+氨茶碱组比较，氨茶碱组血清IL-8、IL-1β水平较低(P<0.05)。见表2。

表2 大鼠血清IL-8、IL-1β水平

3.3 气道平滑肌中TIMP-1、MMP-9水平

与正常组比较，激动剂组、模型组、激动剂+氨茶碱组、氨茶碱组TIMP-1、MMP-9水平较高(P<0.05)；与激动剂组比较，模型组、激动剂+氨茶碱组、氨茶碱组TIMP-1、MMP-9水平较低(P<0.05)；与模型组比较，激动剂+氨茶碱组、氨茶碱组TIMP-1、MMP-9水平较低(P<0.05)；与激动剂+氨茶碱组比较，氨茶碱组TIMP-1、MMP-9水平较低(P<0.05)。见表3。

表3 大鼠气道平滑肌中TIMP-1、MMP-9水平

3.4 大鼠肺部病理学

抑制剂组、模型组气道黏膜上皮脱落，皱襞增多，管壁大量炎性细胞浸润，肺泡结构紊乱，气道壁增厚；抑制剂+氨茶碱组、氨茶碱组气道黏膜上皮少量脱落，黏膜皱襞减少，炎症细胞浸润减轻，肺泡壁轻度膨大、变薄，气道壁改善。见图1。

注：A.正常组；B.激动剂组；C.模型组；D.激动剂+氨茶碱组；E.氨茶碱组。

3.5 大鼠支气管平滑肌厚度

与正常组比较，激动剂组、模型组、激动剂+氨茶碱组、氨茶碱组支气管平滑肌厚度较大(P<0.05)；与激动剂组比较，模型组、激动剂+氨茶碱组、氨茶碱组支气管平滑肌厚度较小(P<0.05)；与模型组比较，激动剂+氨茶碱组、氨茶碱组支气管平滑肌厚度较小(P<0.05)；与激动剂+氨茶碱组比较，氨茶碱组支气管平滑肌厚度较小(P<0.05)。见表4。

表4 大鼠支气管平滑肌厚度

3.6 大鼠TGF-β1/Smads通路相关蛋白表达

与正常组比较，激动剂组、模型组、激动剂+氨茶碱组、氨茶碱组p-NF-κB、TGF-β1、p-Smad2蛋白表达水平较高(P<0.05)；与激动剂组比较，模型组、激动剂+氨茶碱组、氨茶碱组p-NF-κB、TGF-β1、p-Smad2蛋白表达水平较低(P<0.05)；与模型组比较，激动剂+氨茶碱组、氨茶碱组p-NF-κB、TGF-β1、p-Smad2蛋白表达水平较低(P<0.05)；与激动剂+氨茶碱组比较，氨茶碱组p-NF-κB、TGF-β1、p-Smad2蛋白表达水平较低(P<0.05)。见表5、图2。

表5 大鼠肺部TGF-β1/Smads通路相关蛋白表达

注：A.正常组；B.激动剂组；C.模型组；D.激动剂+氨茶碱组；E.氨茶碱组。

4 讨论

目前，COPD的发病机制尚不清楚，故无治愈方法。抑制气道重塑，改善气流受限成为临床治疗的主要方向。氨茶碱在支气管扩张治疗实践中长达半个世纪，但随着吸入皮质激素、β受体兴奋剂等问世，氨茶碱日益被忽视[6]。但近期研究发现氨茶碱有抗炎、免疫调节作用，长期使用可降低气道高反应性，是当前唯一具有支气管扩张、减轻炎症双重效应的药物[7]。故本实验选用氨茶碱治疗COPD，并探讨其作用于肺部及气道的具体机制。

因肺功能测定可反映COPD患者气流阻塞程度，有简单易测、可重复、无创等优势，是评估COPD的必测项目。VT是指机体静息状态每次呼出、吸入的气量，PEF是指深吸气后快速呼气的最高呼气流量，均可反映气道通畅性[8]。结果显示：氨茶碱组VT、PEF水平高于模型组，提示氨茶碱可有效改善COPD肺功能。炎性细胞是在COPD炎症中的主要参与细胞，可产生IL-8、IL-1β等炎症因子，破坏气道结构细胞，加剧炎症反应[9-10]。IL-8为中性粒细胞趋化因子，IL-1β为促炎细胞因子，由支气管上皮细胞等分泌，均有多种生物学作用，是介导炎症反应、促进B细胞增殖的主要因子，在COPD气道炎症中发挥重要作用[11-12]。结果提示，氨茶碱组IL-8、IL-1β水平低于模型组，提示氨茶碱可抑制COPD气道炎症。气道炎症是诱发气道重塑的关键因素，可通过破坏MMPs/TIMPs动态平衡，导致细胞外基质代谢失衡，使纤维蛋白、胶原等过度表达，造成细胞外基质沉积，导致气道壁增厚，即气道重塑的直接体现。据WU L等[13]报道，炎症因子可刺激、促进MMP-9表达。蔡仁萍等[14]研究发现，NF-κB能特异性结合MMP和TIMP基因启动子，调节MMP-9、TIMP-1表达，破坏气道细胞外基质，导致气道重塑。结果显示，氨茶碱组气道平滑肌中MMP-9、TIMP-1表达水平低于模型组，气道平滑肌厚度小于模型组；HE染色观察肺部病理发现，与模型组比较，氨茶碱组气道黏膜上皮破坏、炎性细胞浸润较轻微，共同表明氨茶碱可抑制气道重塑，保护气道结构完整。

NF-κB是调节COPD气道细胞因子网络的枢纽蛋白，也是激活TGF-β1/Smad2通路的上级细胞因子[15-16]。QUAN Y等[17]报道，一般情况下，NF-κB以无活性形式存在于COPD气道黏膜细胞质内，但受到炎症、烟雾等刺激后活化，并转移到细胞核，与TGF-β1活化因子-组织转谷氨酰酶基因启动子结合，激活TGF-β1/Smads通路，增加IL-8、IL-1β等炎症因子释放，反过来可反馈性激活NF-κB/TGF-β1/Smad2通路，形成恶性循环。TGF-β1在COPD、肺纤维化等肺病中均表达上调，可刺激成纤维细胞增殖，促使其向肌纤维细胞转化，通过NF-κB、Smads等通路，影响降解基质蛋白酶活性，促使气道细胞外介质合成、沉积，最终导致气道重塑[18-20]。结果提示，激动剂组、模型组、激动剂+氨茶碱组、氨茶碱组大鼠p-NF-κB、TGF-β1、p-Smad2蛋白表达水平逐渐下调，提示氨茶碱可能通过下调NF-κB/TGF-β1/Smad2通路改善COPD大鼠肺功能以及肺部病理学。

综上所述，氨茶碱可改善COPD症状，可能通过下调NF-κB/TGF-β1/Smad2通路实现。