N+ 离子束注入对毛叶山桐子种子萌发、幼苗生长和碳氮含量的影响

赵子睿，周静波，张 明，姚建铭

(1. 上海伯豪生物技术有限公司，上海 201203；2. 安徽林业职业技术学院资源与环境系，合肥 230031；3. 中国科学研究院等离子体物理研究所，合肥 230031)

山桐子（Idesia polycarpaMaxim.）属于大风子科山桐子属落叶乔木，主要分布于我国长江流域、华北和西北南部的17 个省区。其中，变种毛叶山桐子（I. polycarpaMaxim. var.vestitaDiels）与原种的主要区别在于小枝、叶柄、叶下面及花序均密生短柔毛[1-3]。毛叶山桐子为阳性速生树种，生长迅速，主杆挺直，分枝轮生，树冠圆塔形；果实成熟后呈红、黄等色，垂于枝头，是比较理想的城市绿化、美化和造林的优良树种。同时，毛叶山桐子也是一种木本油料树种，果实和种子都可榨油。毛叶山桐子油主要由亚油酸、油酸、棕榈酸、棕榈烯酸、硬脂酸等脂肪酸组成，可以制备生物柴油和润滑油；经深加工的油脂可以用作降低血脂、血压的药物[4-6]。然而，毛叶山桐子资源有限，主要以产地划分，在自然界种子萌发困难，成片成林的群落较少，这给其广泛、大面积推广栽种造成了极大的困难。因此，研究毛叶山桐子的生态适应性，加快其优质苗木的选育，提高良种化水平成为当务之急。

离子束生物技术是一项新型的生物技术，其原理是在真空条件下，通过离子注入机高压电离气体或金属物质，产生等离体，注入植物材料。通过注入离子的能量传递、电荷传递、质量沉积等多种效应，引起植物体内某些物质或染色体发生变化，再通过人工选育的方法得到良种[7]。离子束注入技术可以产生多种突变性状，在植株表型变化的突变类型主要包括叶色、叶型、花型、花色、株型、生长周期突变等，从而丰富种质资源[8]。目前这项技术已应用于蔬菜[9]、花卉[10]、小麦[11-12]、水稻[13-15]、玉米[16]、甘草[17]和麻风树[18]等的催芽、育种和改良作物品质等领域，但是离子束生物技术处理毛叶山桐子种子所产生的生物效应尚鲜见报道。

本研究旨在将氮离子束生物技术应用到毛叶山桐子的良种培育中，借鉴其在小麦、水稻、蔬菜的催芽和改良品质等领域的方法和经验，研究氮离子束注入毛叶山桐子的种子后对种子萌芽和幼苗表型的生物学效应，以期为园林和林业生产提供优质苗木、促进安徽省山桐子产业的良性发展。

1 材料与方法

1.1 材料

2016 年10 月采集安徽省舒城万佛山农户家的毛叶山桐子果实，用相对湿度60%的细沙于5 ℃冰箱中层积沙藏。12 月取出净种，晾干后放在自封袋中，储存于5 ℃冰箱中待用。

1.2 方法

1.2.1 发芽率测定 2017 年3 月，将种子送往武汉中科光谷绿色生物技术有限公司。微波ECR 离子注入机（IBBe-Device）分别用不同能量的N+离子束20 keV 4×1015、25 keV 4×1015和30 keV 4×1015N+·cm-2（分别简称20、25 和30 keV）注入毛叶山桐子种子。采用随机区组设计，以未经N+离子束注入的毛叶山桐子种子为对照（0 keV，CK），20、25和30 keV 每种处理100 粒种子，3 次重复。3 月24日，取4 种处理的种子各300 粒，分别用下列方法浸种：用1 g·L-1KMnO4消毒种子1 h，15 g·L-1KH2PO4、200 mg·L-1GA3和0.1 g·L-1的生根粉混合溶液浸种24 h。倒出混合液，洗净种子，放在纱布上晾干。3 月27 日，将晾干后的种子分别放在12个铺垫滤纸的培养皿中，每皿100 粒，用水浸湿，定期更换滤纸并加水。盖上培养皿盖，在光照培养箱内催芽，光照培养箱温度设为23 ℃，空气湿度80%，光强2 500 Lx。早晨6:00 开灯，下午18:00关灯。观察记录发芽数，计算发芽率。

1.2.2 容器苗生长指标测定 4 月25 日，将光照培养箱中催芽苗，定植于口径×高为12 cm × 10 cm 的营养钵中，从CK、20、25 和30 keV 4 种处理的所有营养钵苗中，各选择9 株长势相近的幼苗作为样本。采用随机区组设计，每种处理栽植3 盆，每盆栽植1 株，3 次重复，放在光照培养箱中培养，温度设为23 ℃，每天光照12 h。5 月27 日开始，每隔7 d 测定1 次容器苗的株高、冠幅、叶片数，测定方法参考文献[19]，地径用游标卡尺测定，共测定7 次。

1.2.3 叶片全N、全C 含量测定 9 月11 日，分别从CK、20、25 和30 keV 4 种处理容器苗9 株样本中，剪取叶片，每株从基部开始向上取6 片叶，在水龙头下冲洗干净，吸水纸吸干。4 个处理样本的叶片分别放于9 个牛皮纸信封中，共36 个信封放在电热鼓风干燥箱中，105 ℃杀青20 min，再于50 ℃烘干96 h；9 月18 日，用高速万能粉碎机将叶片研成粉状。9 月20 日使用元素分析仪（EA3000，Vector，Italy）测定全N、全C 的含量。

1.3 数据分析

为比较不同能量的N+束对毛叶山桐子种子萌发和幼苗生长的影响，采用单因素方差分析（One-way ANOVA）进行不同处理间的显著性检验，具有显著性差异的进一步进行Tukey 多重比较（HSD），统计分析在统计软件R（4.0.2 版本）进行，加载multcomp、car、agricolae 等软件包，作图在Excel 中进行。

2 结果与分析

2.1 不同能量N+离子束注入毛叶山桐子种子对其发芽率的影响

从图1 可以看出，催芽后的21、22、26 和27 d，30 keV 处理的种子发芽率与CK 差异都显著，而20和25 keV 处理的种子发芽率与CK 差异都不显著；催芽后的10 ～ 20 d 和23 ～ 25 d，20、25 和30 keV处理的种子发芽率与CK 的差异都不显著。结果表明30 keV N+离子束注入毛叶山桐子种子对发芽率起显著增加作用，而20 和25 keV N+离子束注入种子对发芽率的的作用不显著。

图1 不同能量N+离子束注入后对毛叶山桐子种子发芽率的影响Figure 1 Effects of different energy N+ ion beam exposure on the germination rate of I. polycarpa var. vestita seeds

2.2 不同能量N+离子束注入毛叶山桐子种子对其容器苗生长的影响

2.2.1 不同能量N+离子束注入种子对毛叶山桐子容器苗株高的影响 从图2 可以看出，20 keV 处理的毛叶山桐子容器苗，在定植47 d 时，株高与对照差异显著，30 keV 处理的容器苗，在定植61 和68 d时，株高与对照差异显著，25 keV 处理的容器苗，在47、61 和68 d 时，株高与对照差异都不显著；定植40、54 和75 d 时，20、25 和30 keV 处理的容器苗，株高与对照差异都不显著。说明20 和30 keV 的N+离子束注入毛叶山桐子种子，对容器苗的株高增加有一定的促进作用，而30 keV 处理的容器苗株高增长更快一些。

图2 不同能量N+离子束注入对毛叶山桐子幼苗株高影响Figure 2 Effects of different energy N+ ion beam exposure on the height of I. polycarpa var. vestita seedlings

2.2.2 不同能量N+离子束注入种子对毛叶山桐子容器苗冠幅的影响 从图3 可以看出，30 keV 处理的毛叶山桐子容器苗，在定植61 d 时，冠幅与对照差异显著，在定植54、68 和75 d 时，虽然与对照差异不显著，但是都大于对照，20 keV 处理的容器苗，在定植54、61、68 和75 d 时，冠幅与对照差异不显著，而且都小于对照；25 keV 处理的容器苗，定植54、61、68 和75 d 时，冠幅与对照差异不显著，同时都小于30 keV 处理的容器苗；说明30 keV的N+离子束注入毛叶山桐子种子，对容器苗冠幅的增加起一定的作用。

图3 不同能量N+离子束注入对毛叶山桐子幼苗冠幅影响Figure 3 Effects of different energy N+ ion beam exposure on the crown diameter of I. polycarpa var. vestita seedlings

2.2.3 不同能量N+离子束注入种子对毛叶山桐子容器苗叶片数的影响 从图4 可以看出，30 keV 处理的毛叶山桐子容器苗，在定植54 d 时，叶片数与对照差异显著，定植61、68 和75 d，虽然与对照差异不显著，但都是多于对照，20 和25 keV 处理的容器苗，在定植54、61、68 和75 d 时，叶片数与对照差异都不显著；说明30 keV 处理对于毛叶山桐子容器苗的叶片增加有一定的促进作用。

图4 不同能量N+离子束注入对毛叶山桐子幼苗叶片数的影响Figure 4 Effects of different energy N+ ion beam exposure on the leaf number of I. polycarpa var. vestita seedlings

2.2.4 不同能量N+离子束注入种子对毛叶山桐子容器苗地径的影响 从图5 可以看出，在定植47、54、61、68 和75 d 时，30 keV 处理的毛叶山桐子容器苗，地径虽然与对照差异不显著，但在数值上都大于对照，而且有上升的趋势；20 keV 处理的容器苗，地径与对照差异都不显著，只有定植47 d 时，略高于对照，其他都是小于对照；25 keV 处理的容器苗，地径与对照差异也不显著，只有定植47 和68 d时，略高于对照，其他也都小于对照。说明30 keV处理对于毛叶山桐子容器苗地径的增加略有作用。综上所述，20 keV 处理的N+离子束注入毛叶山桐子种子，对容器苗的株高增加有一定的促进作用，对冠幅、叶片数、地径增加没有显著的影响；25 keV处理的N+离子束注入毛叶山桐子种子，对容器苗的株高、冠幅、叶片数、地径的增加都没有显著的影响；30 keV 处理的N+离子束注入毛叶山桐子种子，对容器苗的株高、冠幅、叶片数的增加都有显著的影响，对地径增加影响虽然不显著，但是从数值上来看，高于对照。说明30 keV N+离子束注入毛叶山桐子种子，在容器苗定植后，对其株高、冠幅、叶片数和地径增加都有促进作用，可以用该法培养株高、冠大、叶片多和地径粗的容器苗，为园林和林业生产提供优质苗木。

图5 不同能量N+离子束注入对毛叶山桐子幼苗地径影响Figure 5 Effects of different energy N+ ion beam exposure on the ground diameter of I. polycarpa var. vestita seedlings

2.3 不同能量N+离子束注入种子对容器苗叶片全C、N 含量的影响

从图6 可以看出，容器苗定植140 d（9 月11日），20、25 和 30 keV 处理的毛叶山桐子叶片中的全氮含量与对照差异都显著。20 和25 keV 处理叶片中的全碳含量与对照差异显著；而30 keV 处理的毛叶山桐子叶片中的全碳含量与对照差异不显著。从图7 可以看出，20 keV 处理的毛叶山桐子叶片中的C / N 与对照差异不显著，而25 和30 keV处理与对照差异显著，都小于对照，30 keV 最小。

图6 不同能量N+束注入对毛叶山桐子幼苗叶片全碳和全氮含量的影响Figure 6 Effects of different energy N+ ion beam exposure on total C and N contents in the leaves of I. polycarpa var. vestita seedlings

图7 不同能量N+束注入对毛叶山桐子幼苗叶片碳氮比的影响Figure 7 Effects of different energy N+ ion beam exposure on C/N in the leaves of I. polycarpa var. vestita seedlings

综上所述，这4 种能量的N+离子束注入毛叶山桐子种子，经过催芽、定植，140 d 后的容器苗，其样本每千克叶片中的含氮量（g）与对照差异都显著，说明这几种能量的N+注入毛叶山桐子种子，对种苗生长叶片中的含氮量增加起促进作用，有利于植株的营养生长。这也从氮营养方面说明了30 keV 处理的毛叶山桐子株高、冠幅、叶片数等营养指标显著差异于对照的原因，但从图6 中并没有看到20、25和30 keV 处理之间每千克叶片含N 量（g）的差异，说明这几种处理在株高、冠幅、叶片数、地径等形态上的差异可能还有其他内因，有待进一步研究。

3 讨论与结论

植物个体发育的起点从种子萌发开始，播种后种子能否迅速萌发，达到早苗、全苗和壮苗，关系到能否为作物的丰产打下良好的基础[20]。植物的生长是一种不可逆的体积增加的过程。植物的体积大小（通常可以用长度或直径来代表）可以作为测量植物生长的一个重要指标[21]。植物的株高、冠幅、叶片数和地径可以很好地反映植物的生长状态。30 keV 注入毛叶山桐子种子，无论在发芽率，后期容器苗的株高、冠幅、叶片数等形态指标，都显著差异于未处理的对照。20 keV 注入毛叶山桐子种子，其发芽率与CK 差异不显著；对容器苗的株高增加有一定的促进作用，对冠幅、叶片数、地径增加没有显著的影响。25 keV 注入毛叶山桐子种子，其发芽率与CK 差异不显著；对容器苗的株高、冠幅、叶片数、地径的增加都没有显著的影响。基于上述结果，不难看出30 keV 注入毛叶山桐子种子，显著提高了种子的发芽率，促进了株高、冠幅、叶片数、地径的生长，是适宜于毛叶山桐子种子的萌发、植株营养生长的N+离子束注入能量。

代西梅等[22]用能量为30 keV 的N+离子束注入马齿苋，提高了种子的萌发速率、发芽率相一致。周立人等将30 keV 的离子束注入大麦种胚后，不仅对种子本身萌发能力和M1 代胚根、胚芽细胞的有丝分裂有促进作用，还对胚根根尖细胞和胚芽细胞内的核及染色体产生不同程度损伤，表现出核和染色体畸变[23]。黄洪云等年用能量为30 keV 的离子束注入玉米种子，种子电导率和幼苗叶片MDA 含量均较低，对细胞膜的破坏性小[24]。郭建秋等研究采用能量为 30 keV 的氮离子束注入大豆的种子，结果与航天搭载处理M1 代的出苗率、株高、单株荚数、单株粒数无显著差异[25]。樊继伟等试验中氮离子束注入能量只有 1 个水平（30 keV），氮离子束注入后，小麦诱变群体氮素利用产生一定变化，影响产量和品质[26]。这些研究的结论与本试验的结果一致。

叶片是植物进行光合作用的主要器官，不仅对环境变化敏感，而且可塑性大。作为植物固碳能力的指标，叶片碳含量是植物适应环境变化，维持碳平衡的重要参数。氮是蛋白质、核酸、磷脂的主要成分，而这三者又是原生质、细胞核和生物膜的重要组成部分，因此，氮在植物生命活动中占首要地位[27]，含氮量影响植株的营养生长。20 keV 处理的毛叶山桐子每kg 样本叶片中的含C 量和含N 量与对照差异显著；25 keV 处理的毛叶山桐子叶片含C量和含N 量与对照差异也显著；30 keV 处理的毛叶山桐子叶片含C 量与对照差异不显著，但是略高于对照，含N 量与对照差异显著。说明20 和25 keV处理对毛叶山桐子幼苗叶片的固碳能力有一定的促进作用。叶片中的含碳量在采用N+离子束注入后都有增加，但增加幅度随N+离子束能量增加而减小；而含氮量各处理基本一致（图6），也即是说，随着N+离子束能量增加，其C/N 比值在减小（图7）。熊炳霖等的研究结果表明，叶绿素含量和碳氮比呈极显著的负相关[28]，30 keV 处理的毛叶山桐子叶片C/N 最小，叶绿素含量高，光合效率好，有助于叶片的生长和发育，这从植物发育生理上解释了部分试验结果。

本研究采用0、20、25 和30 keV 等4 个不同能量N+离子束注入毛叶山桐子种子进行试验，筛选出30 keV 4×1015N+·cm-2为适宜注入剂量，显著增加了种子发芽率、株高、冠幅、叶片数和叶片中氮的含量，有利于植株的营养生长。该方法对其他观赏植物优质苗木培育也有较大的参考价值。