茭白叶斑病病原鉴定及其对5 种杀菌剂的敏感性测定

蒋冬阳，陈夕军，陈银凤，陈 宸，张治平，魏利辉

（1.扬州大学植物保护学院 江苏 扬州 225009； 2.扬州市邗江区农作物技术推广中心 江苏 扬州 225100；3.江苏省农业科学院植物保护研究所 南京 210014）

茭白（）又叫作茭瓜、茭笋、高笋、菰首，是我国的一种重要水生蔬菜，主要种植于长江中下游及其以南省份，包括江苏、浙江、安徽、福建、湖北、湖南和广东等，已有2000 多年的栽培历史。近年来，随着人们对高品质蔬菜的需求越来越大，茭白的种植面积逐年增长，并不断有新品种被推出。在有些地区，通过人工湿地中的野茭白可对排入的酸性重金属废水进行净化处理。在茭白栽培过程中，可能受到多种病害的侵袭，如茭白胡麻叶斑病（）、茭白锈病（）、茭白纹枯病（）、茭白褐色菌核病（-）和茭白瘟病（）等。与其他蔬菜相比，虽然茭白的种植面积近年来有所增加，但仍属于小众蔬菜，有关茭白特别是茭白病害研究的报道并不多，目前已报道的茭白病害仅10 余种。且已有的多数研究只对茭白病害进行简单的症状描述，从病害症状、病原种类与生物学特性、病害发生规律、影响病害发生因素以及病害防治等方面进行系统研究的报道较少。因此，进一步分离鉴定田间引起茭白病害的病原物，对茭白病害的诊断与防控具有重要意义。

关于茭白病害防控的药剂，目前仅有井冈霉素和噻呋酰胺被登记用于防治茭白纹枯病，丙环唑和咪鲜胺登记用于防治茭白胡麻叶斑病。杨绍丽等测定了苯醚甲环唑、丙环唑、甲基硫菌灵和福美双等8 种药剂对茭白胡麻叶斑病（.）的室内毒力，发现有3 种药剂的EC值小于0.1 μg·mL，具有很好的应用潜力。在茭白分蘖盛期用24%噻呋酰胺300～450 mL·hm喷施，药后20 d 对茭白纹枯病的防效在82.64%～85.44%。此外，腈菌唑、稻瘟灵、咪鲜胺、己唑醇、嘧菌酯等也常被用于茭白相关病害的防控。但由于登记药剂较少，生产中农民多凭经验甚至任意用药，不仅造成田间防效差，而且加重对环境的污染，食品安全也得不到有效保证。翁丽青等测定了7 种药剂对茭白胡麻叶斑病的防效，12.5%烯唑醇可湿性粉剂2500 倍液施用2次后，7 d 和14 d 防效最高也仅为64.0%和55.67%，其他药剂效果更差。因此，笔者在分离鉴定茭白叶斑病病原的基础上，测定了5 种常用杀菌剂对叶斑病菌的毒力，以期为生产上茭白叶斑病的防控提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 供试材料

供试品种：浙茭7 号。供试仪器：PCR 仪[德国艾本德（Eppendorf）股份公司]、凝胶成像系统、电泳仪[伯乐（BIO-RAD）生物科技有限公司]。供试试剂：DNA 提取试剂（北京索来宝科技公司）、ExTaq酶[大连宝生物（TaKaRa）公司]、T4 DNA 连接酶、pMD 19-T 质粒、大肠杆菌DH5 α 感受态[赛默飞世尔（Thermo Scientific）科技公司]。供试农药：97%氟环唑原药、95%己唑醇原药（江苏丰登作物保护有限公司），98%吡唑醚菌酯原药（山东省联合农药工业有限公司），97%咪鲜胺原药、97%咯菌腈原药（江苏云帆化工有限公司）。

1.2 菌株分离

茭白叶斑病病样于2019 年7 月采自江苏省扬州市邗江区丁沟镇。取田间采集的新鲜发病叶片，于室内用去离子水冲洗表面后，取病健交界处组织于10%次氯酸钠溶液中消毒20～30 s，无菌水漂洗3次后置于无菌滤纸上，吸干水分后将病组织置于含有乳酸[每1000 mL 培养基加12 mL 25%乳酸（，下同）]的马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA，200 g 马铃薯，17 g 葡萄糖，20 g 琼脂粉，1000 mL 水）上，于25 ℃恒温培养箱中黑暗培养。待组织边缘长出菌落，用挑针取一小块回接至PDA 平板，待菌落长满平板后，挑取菌丝于显微镜下观察，镜检是否只有一种菌丝和孢子。若是，则表明获得纯培养菌株，并将该菌株移至PDA 斜面，待菌落长满斜面后4 ℃冰箱保存，备用。

1.3 病原菌致病性测定

通过离体叶片接种法测定病原菌致病性。2020 年5 月，于扬州市邗江区瓜洲蔬菜基地取健康茭白叶片，95%酒精表面消毒后用无菌水冲洗干净，然后平铺于垫有3 层棉纱布（完全浸润）的白瓷盘上。将50 μL 1.0×10个孢子·mL孢子液滴在茭白叶片表面，以不接菌处理作对照，每个处理5 个叶片，3 次重复。用保鲜膜密封瓷盘，置于扬州大学作物病害综合防控实验室25 ℃恒温光照箱中，12 h/12 h（光/暗）交替培养，观察病斑情况。

1.4 病原菌形态学鉴定

将分离纯化后得到的菌株接种到PDA 平板中央，25 ℃黑暗条件下培养5 d，肉眼观察菌落形态特征，十字交叉法测量菌落直径。用挑针挑取菌落边缘菌丝制成玻片，在显微镜下观察菌丝形态。将从菌落边缘挑取菌块接种至燕麦培养基上，25 ℃黑暗条件下培养30 d，用挑针挑取病原菌孢子制成水浸片，在显微镜下观察分生孢子和分生孢子梗形态，测量孢子大小，共计100 个孢子。

1.5 病原菌分子生物学鉴定

收集马铃薯葡萄糖培养液（PDB）中生长36 h的菌丝，50 ℃烘箱中干燥48 h 后，按北京索来宝科技公司真菌基因组DNA 提取试剂盒操作步骤提取菌株DNA，以真菌ITS 区通用扩增引物ITS4/ITS5（ITS4：GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG；ITS5：TCCTCCGCTTATTGATATGC）对菌株DNA 进行PCR 扩增。扩增体系为：模板2 μL，DNA 聚合酶0.5 μL，10×Buffer 2 μL，dNTP Mixture 0.5 μL，ITS4/ITS5 各1 μL，ddHO 13 μL，反应体系总计20 μL。扩增程序为：94 ℃5 min；94 ℃45 s，60 ℃45 s，72 ℃50 s，30 个 循 环；72 ℃延 伸10 min。PCR 产物经回收后，连接至大肠杆菌DH5α，并送南京擎科生物技术公司进行测序。所得序列在GenBank 中进行序列比对后，利用MEGA7.0 软件构建系统进化树。

1.6 菌株的生物学特性测定

配置供试的6 种培养基。（1）基本培养基：硫酸铵2.0 g、硫酸镁0.2 g、氯化钙0.01 g、硫酸亚铁0.001 g、磷酸氢二钠1.5 g、磷酸二氢钾1.5 g、蔗糖10 g、琼脂20 g，水1000 mL；（2）马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g，水1000 mL；（3）燕麦培养基：燕麦粉30 g、琼脂20 g，水1000 mL；（4）Czapek 培养基：硝酸钠2.0 g、磷酸氢二钾1.0 g、氯化钾0.5 g、硫酸镁0.5 g、硫酸亚铁0.01 g、蔗糖30 g、琼脂20 g，水1000 mL；（5）Richard 培养基：硝酸钾10 g、磷酸氢二钾5 g、硫酸镁2.5 g、硫酸亚铁0.02 g、蔗糖50 g、琼脂20 g，水1000 mL；（6）肉汁胨培养基：酵母浸膏1.0 g、牛肉浸膏3.0 g、蛋白胨10 g、蔗糖10 g、琼脂20 g，水1000 mL。

最适温度与最适pH 值试验，设定处理为5、10、15、20、25、28、30、35、37 ℃和pH 值3～11；光照条件设定为光照、黑暗或光/暗（12 h/12 h）交替，培养基均为PDA。碳源利用试验，设定在基本培养基中加入等量葡萄糖含量、麦芽糖、淀粉、半乳糖、鼠李糖或甘露糖替换蔗糖；氮源利用试验直接在基本培养基中加入与2.0 g 硝酸钠含量相当氮元素的硝酸钾、硝酸钙、硝酸铵、氨化氨或尿素。取PDA 平板菌落边缘6 mm 菌丝块接于新的平板中央，除温度或光照试验外其他均置于25 ℃培养箱中黑暗培养，5 d 后通过十字交叉法测量菌落直径。每个处理3 皿，试验设3 次重复。

1.7 5种杀菌剂对2种茭白叶斑病菌的毒力测定

采用菌丝生长速率法测定己唑醇、吡唑醚菌酯、咪鲜胺、氟环唑和咯菌腈对2 种茭白叶斑病菌的毒力。将己唑醇、吡唑醚菌酯、咪鲜胺、氟环唑和咯菌腈分别溶于丙酮（每0.01 g 原药加入200 μL 丙酮）中，完全溶解后使用ddHO 配制成1000 μg·mL母液，按比例加入灭菌的PDA 培养基中，制成系列浓度梯度的含药PDA 平板（表1），以不加药剂的平板为对照。在28 ℃黑暗条件下培养4 d 的菌落边缘打孔，取直径6 mm 的菌丝块接种于含药培养基中央。25 ℃恒温培养箱中黑暗条件下培养5 d，待对照平板菌落直径近长满整个平板时，测量各处理菌落直径。每个处理3 皿，3 次重复。根据病菌在不同浓度药剂平板上的线性生长速率，计算生长抑制率。以药剂浓度对数值为自变量（），以菌落生长抑制百分率转换成概率值为因变量（），求毒力回归方程（=a+b）和相关系数（），并计算出EC值。

表1 5 种杀菌剂供试浓度梯度

式中，表示菌落生长抑制百分率；D表示对照菌落直径；D表示处理菌落直径。

1.8 数据统计

使用DPS V6.55L 软件进行单因素方差分析，采用Duncan 新复极差法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 2种茭白叶斑病的田间症状

2019 年7 月，于扬州市郊发现大量茭白田块出现叶斑病（图1），且病斑形状有差异。一种病斑初期为小褐点，病斑扩展后呈圆形至长椭圆形，中间枯白色，次外层为褐色，最外层有黄色晕圈，病健交界明显，病斑大小为（1～2）mm×（2～4）mm；另一种病斑为圆形至梭形，中间枯白色，外层为深褐色，两端有褐色坏死线，病健交界不明显。

2.2 致病性测定

从2 种叶斑病病叶上分离病原菌，得到纯培养，图1-A 病叶上分离的病原菌命名为JBYB1，图1-B 病叶上分离的病原菌命名为ZLC1。JBYB1 菌株在PDA 培养基上菌落初为灰白色，气生菌丝绒状且致密，后期菌落呈灰褐色，可产生褐色色素；ZLC1 菌丝初期白色，后期灰黑色，可产生深黑色色素（图2-A）。以2 种病原菌孢子液接种茭白离体叶片，48 h 后，以JBYB1 接种的茭白叶片开始出现黄褐色坏死斑块，72 h 后病斑非常明显，且边缘有黄色晕圈；以ZLC1 孢子液接种的茭白叶片上出现大量褐色圆形至椭圆形病点，病斑外有黄色晕圈，后许多小点斑愈合形成不规则大斑（图2-B）。说明分离获得的两种病原菌均为茭白的致病菌。

图1 茭白2 种叶斑病症状

图2 接种JBYB1 和ZLC1 后茭白叶片症状

2.3 JBYB1菌株的鉴定

JBYB1 的菌丝为有隔菌丝，初期白色，后期深褐色（图3-A）；黑暗条件下25 ℃恒温培养30 d 可产生大量深褐色黏质团，为病原菌的分生孢子堆（图3-B）；分生孢子梗有隔，呈曲膝状（图3-C）；分生孢子呈倒棍棒形，表面光滑，脐点平截至略突出，有5～8 个隔膜，大小为（73.27～89.48）μm×（19.28～29.88）μm（图3-D）。

图3 菌株JBYB1 形态

采用病原真菌ITS 区扩增通用引物ITS4/ITS5扩增JBYB1 基因组DNA，扩增产物大小为600 bp左右（图4-A）。将扩增产物连接至pMD19-T，获得的阳性转化子经PCR 验证后送南京擎科生物科技有限公司测序，结果显示，扩增产物长为600 bp（图4-B）。经NCBI 比对结果显示，其与稻双极蠕孢菌（）具有较高的同源性，在覆盖率98%的基础上二者相似度达98%；而与原属长蠕孢属的其他两个属——德氏蠕孢属、突脐蠕孢属的ITS 区分属不同进化分支，即使在双极蠕孢属同属间与其他种距离亦较远（图4-C）。因此，鉴定JBYB1 菌株为稻双极蠕孢菌。采用组织分离法重新从发病叶片上分离病原菌，并将分离的病原菌接种至燕麦培养基，可以观察到相同形状的分生孢子，说明所分离的病原菌为引起茭白叶斑病的病原。

图4 菌株JBYB1 的分子生物学鉴定

2.4 菌株的生物学特性

JBYB1 和ZLC1 在供试的温度和pH 值范围内均能生长，但最适生长温度和pH 值分别为25～28 ℃、25～30 ℃（图5-A）和pH 值6～7（图5-B）；光照对JBYB1 的生长没有影响，但显著抑制了ZLC1的生长（图5-C）；供试培养基以PDA 为最佳（图5-D），碳源为葡萄糖和蔗糖菌株长势较好（图5-E）；在氮元素含量相当的情况下，不同硝态氮对病原菌生长影响差异不大，但在氮元素含量相同的情况下，病原菌对氨态氮的利用效果明显较差（图5-F）。

图5 不同条件下JBYB1 和ZLC1 的菌落直径

2.5 5种杀菌剂对茭白胡麻叶斑病菌的毒力测定

采用菌丝生长速率法测定了己唑醇、吡唑醚菌酯、咪鲜胺、氟环唑和咯菌腈对JBYB1 和ZLC1 的毒力。结果表明，5 种药剂对2 种茭白叶斑病菌均有较好的抑制效果，对JBYB1 的EC值分别为0.256 9、0.898 8、12.786 2、1.942 8、0.070 9 μg·mL（表2），对ZLC1 的EC值分别为0.794 4、0.089 6、16.208 8、1.708 8、0.028 6 μg·mL（表3）。说明这几种药剂均可用于茭白叶斑病的防治。

表2 5 种杀菌剂对JBYB1 的毒力

表3 5 种杀菌剂对ZLC1 的毒力

3 讨论与结论

茭白是我国的一种重要水生蔬菜，在长江中下游地区普遍种植。已有多种茭白病害被报道，如胡麻叶斑病、锈病、纹枯病、褐色菌核病和茭白瘟病等。但对于茭白病害的系统研究较少，特别是一些易于混淆或症状相似的病害，常被认为是一种病害。甚至有着相似的症状，经鉴定后为不同的病原。如茭白灰心斑病（又称茭白瘟病），最初通过形态学方法鉴定其为。刘锦涛等通过形态结合分子生物学的方法，又将其病原鉴定为，这到底是前期鉴定有误，还是本就是两个病原还不得而知。笔者于2019 年在扬州市进行茭白病害调查时发现，被当地植保技术人员称为茭白胡麻叶斑病的茭白叶片上的病斑并不完全相同。经分离鉴定发现，一种病斑圆形至长椭圆形，病斑中间枯白色、次外层褐色、最外层为黄色晕圈，且病健交界清晰的为茭白胡麻叶斑病，病原为稻双极蠕孢菌。另一种病斑圆形至梭形、中间枯白色、外层深褐色，有时两端可见明显的褐色坏死线，是一种新的病害，命名为茭白弯孢叶斑病，病原为竹节蓼弯孢菌。已有报道显示，该病原菌可导致杉木叶斑病，也有从菜豆或豌豆病根部分离得到该病原菌的报道。

截至目前，生产上还未见有育成的抗胡麻叶斑病的茭白品种，主要是通过化学药剂来防治茭白胡麻叶斑病。杨绍丽等测定了8 种杀菌剂对茭白胡麻叶斑病菌的毒力，发现苯甲·丙环唑、百菌清、苯醚甲环唑等几种单剂或复配剂对茭白胡麻叶斑病菌均有较好的抑制效果，EC值均小于0.1 μg·mL。丙环唑、己唑醇、唑醚·氟酰胺、嘧菌酯等对茭白胡麻叶斑病防效均可达80%。唑醚·氟酰胺、代森锰锌在2 次药后第9 天对茭白胡麻叶斑病的防效为76.69%和74.78%，在药后14 d 可达88.83%和86.11%。笔者的研究结果表明，己唑醇、吡唑醚菌酯、咪鲜胺、氟环唑和咯菌腈对茭白的2 种叶斑病菌均有较高的毒力，除咪鲜胺的EC值大于10 μg·mL外，己唑醇、吡唑醚菌酯和咯菌腈的EC值均小于1.0 μg·mL，甚至低于0.1 μg·mL，说明这些药剂均可用来登记防治茭白的2种叶斑病。但我国农药使用条例明确规定，化学农药在田间应用时非登记不得使用。因此，在该研究结果的基础上，进一步验证这些药剂对茭白叶斑病的防治效果，将为这些药剂的登记和在生产中的使用提供依据。

综上所述，茭白叶斑病可能由多种病原菌引起，如.和.等。笔者的研究结果显示，目前生产上常用的广谱性杀菌剂，如己唑醇、吡唑醚菌酯和咯菌腈等对这2 种叶斑病菌均有较好的毒力，可用于田间茭白叶斑病的防治。