核桃饼粕、三七花复合发酵饮品制备及功效研究*

徐田，耿树香，宁德鲁，叶永丽，高丽辉

(1.云南省林业和草原科学院，云南 昆明 650201；2.江南大学，江苏 无锡 214122；3.昆明医科大学，云南 昆明 650500 )

核桃仁具有较高的营养价值和经济价值，有着“益智果”“长寿果”的美誉[1]。目前核桃加工的主要产品为核桃油、核桃乳、核桃蛋白粉、核桃仁休闲食品等，核桃产品种类较为单一，产品深加工基础较为薄弱。在核桃油生产的过程中，可获得大量的加工副产物，即核桃粕。核桃粕中富含蛋白质，还含有维生素、磷脂、胡萝卜素、多酚类、黄酮类、三萜类、糖苷类、微量元素等多种营养物质[2-4]。由于榨油工艺的要求，去壳核桃粕中蛋白含量高达35%～50%，多用于制备核桃蛋白粉及肽。因核桃蛋白含70%以上的谷蛋白，在制备过程中所用工艺酸或碱水解法存在严重的消旋作用，无法被人体同化，且在脱除强酸碱时对环境污染加大，该方法被淘汰。用酶解法生产蛋白及肽粉投资成本较大，无法产业化应用，其产品附加值未得到较好发挥，不仅造成核桃资源的浪费，还限制核桃精深加工[5-11]。

为充分利用核桃加工副产物——饼粕，提高资源利用率以及丰富市场核桃产品，本研究以核桃粕为原料，结合具有多种生物功能的三七花、枸杞和红枣进行有益菌发酵制备混合发酵饮品。一方面，由于原料中富含蛋白质、氨基酸、黄酮、总皂苷、多糖等生物活性物质，发酵饮品具有如抗氧化、清热解毒、降压调脂、提高免疫力等的功能性；另一方面，实现了核桃副产物的深加工及综合利用，开发出高附加值产品，具有非常重要的经济价值。

1 材料、工艺与方法

1.1 试验材料

原料核桃饼粕取自2020年的‘云南漾泡’核桃纯物理压榨物，辅料为三七(Panaxnotoginseng)花、枸杞(Lyciumchincnse)、红枣(Ziziphusjujube)采购于药店。

试剂 四氧嘧啶(批号08865)，二甲双胍(中美上海施贵宝制药有限公司，规格0.25 g，批号AAN6717)，葡萄糖测定试剂盒(上海荣盛生物药业有限公司，批号20200905137)，猪油(上海枫未实业有限公司，批号20201027)，非诺贝特(200 mg/粒，批号30586)，血脂四项联检试剂盒(三诺生物传感股份有限公司，批号01J0922)。

动物 健康SD大白鼠(Musmusculus)〔雄性，体重180～220 g，由成都达硕实验动物有限公司提供[实验动物生产许可证号：SCXK(川)2020-030]〕，健康ICR小白鼠〔雄性，体重18～22 g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供[实验动物生产许可证号：SCXK(湘)2019-0004]〕。

饲养条件 室温为(25±2)℃，相对湿度60%～70%。

仪器 美国BIO-TEK Synergy 2 酶标仪，三诺ICARE-2000生化分析仪。

1.2 制备工艺

配方 榨油后获得的核桃饼粕60 g，三七花7 g，枸杞3 g，大枣3 g，饮用水500 g，蜂蜜5 g，乳杆菌发酵剂0.4 g，低聚果糖8 g。

具体步骤为：

(1)核桃饼粕预处理 除去发生氧化有哈喇味的饼粕，将其余饼粕打散成小块状，剔除可能在榨油时带入的异物。

(2)三七花预处理 优选新鲜紧簇、无腐烂的三七花，纯净水清洗后烘干备用。由于三七花保鲜期短，容易氧化变黑影响发酵产品的品质，且三七花数量大存放时散热困难易引起腐烂，无法保证发酵所用原料的质量，因此将三七花烘干后备用。

(3)枸杞预处理 挑选优质枸杞，剔除枝叶等杂质，用清水冲洗1～2次，沥干水份备用。

(4)红枣预处理 挑选优质无虫蛀、大小均匀的干红枣，清洗2次除去表面尘土，用粉碎机捣碎备用。

(5)乳杆菌发酵剂 乳杆菌发酵剂由嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)、保加利亚乳杆菌(L.delbrueckiisubsp)、干酪乳杆菌(L.casei)3种乳杆菌混合得到。分别将上述3种经复苏且生长状态良好的乳杆菌接种至MRS液体培养基中，于37 ℃下摇床120 r/min培养48 h，将培养液于5 000 r/min、4 ℃离心5 min，收集菌体，并用无菌生理盐水分3次洗涤菌体。将嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、干酪乳杆菌按重量比1︰2︰2混合得到乳杆菌发酵剂。

(6)调配 将准备好的核桃粕、三七花、枸杞、红枣原料按比例移至发酵用桶内， 依次加入约400 g饮用水、5 g蜂蜜、0.4 g发酵乳杆菌(乳杆菌的添加量要求总的活菌数达108 CFU/mL以上)，最后将剩余饮用水(100 g)全部加入搅拌混匀。

(7)发酵处理 用保鲜膜密封桶口后盖桶盖，进行厌氧发酵，室温约为26 ℃，发酵时间20 d。

(8)过滤 发酵结束后，用搅拌器或不锈钢勺略加搅拌，然后用滤布袋进行过滤，将发酵液与发酵原料初步分离，得到粗滤液；粗滤液再经超滤装置进行精滤，滤膜为直径50 nm的无机陶瓷膜，过滤压力0.2～0.25 MPa，滤液流速100 mL/min。

(9)二次调配 精滤后的发酵液中加入按发酵液100 g重量计的8 g低聚果糖，搅拌混匀，调整发酵液的糖度和甜度。

图1 核桃饼粕发酵饮品的制备工艺Fig.1 Preparation technology of walnut cake fermented beverage

1.3 方法

1.3.1 发酵饮品生物活性及抗氧化指标检测

活菌计数采用显微镜直接计数法计算单位重量菌数；基本成分测定参照食品卫生检验方法系列标准(总蛋白含量测定参照国家标准GB 5009.5-2016[12])；粗脂肪含量测定参照国家标准GB 5009.6-2016[13]；游离氨基酸测定参考国家标准GB 5009.124-2013[14]，样品不经水解，仅取一定量样品加入等体积5%三氯乙酸沉淀蛋白，3 000 rpm离心5 min取上清液400 μL进样检测，其它操作与GB标准相同；多糖含量测定参照国家标准GB 5009.7-2016[15]。

总酚(没食子酸当量)含量采用Folin法测定 取一定量样品稀释至基本无色，记录稀释倍数；取稀释后溶液0.15 mL于试管中，加入1.5 mL稀释10倍的Folin试剂，混匀；静置5 min后加入1.5 mL 6%(w/v)Na2CO3溶液，将试管置于75 ℃恒温水浴箱中孵育10 min。随后取出立即冰水浴冷却，转移至离心管中 5 000 rpm、4 ℃离心5 min。于725 nm波长下测定吸光值，重复测定3次。以没食子酸为标准品，绘制标准曲线，计算样品中总酚含量。

总皂苷含量测定参考保健食品中总皂苷测定方法 吸取1 g样品进行稀释，取稀释后的样品1 mL进行层析。层析柱内装填3 cmAB-8大孔树脂、1 cm中性氧化铝、25 mL 70%乙醇淋柱，再用25 mL水洗柱，弃掉淋洗液，准确加入1.0 mL样品溶液，25 mL水淋洗柱，弃洗脱液，再用25 mL 70%乙醇洗脱总皂苷，收集该洗脱液于蒸发皿中，置于60 ℃水浴中挥干。往蒸发皿中加入0.2 mL 5%香草醛冰乙酸溶液，充分溶解残渣，加入0.8 mL高氯酸，混匀后转入试管中，60 ℃水浴10 min，取出冷却后加入5 mL冰乙酸，混匀后560 nm比色测定。采用人参皂苷Re标品中绘制标准曲线，计算样品中总皂苷含量。

黄酮含量测定 精确吸取1.0 mL样品溶液于25 mL容量瓶中，加1 mL 5%NaNO2溶液摇匀，放置5 min，再准确加入10%Al(NO3)3溶液1 mL摇匀，放置6 min，然后加入5 mL 4%NaOH溶液，最后用30%甲醇稀释到刻度，于温水浴中加热10 min，取出，同时作试剂空白，以芦丁为标准品绘制标准曲线，于510 nm波长处测定吸光度A，查标准曲线，计算样液中黄酮含量。

FRAP、DPPH、ABTS 3个指标均按照上海碧云天公司对应检测试剂盒的操作方法进行测定。

1.3.2 调节血糖试验

(1)复制四氧嘧啶性糖尿病小鼠模型 90只(30±2)g ICR雄性小鼠，称重编号。动物禁食6 h，小鼠尾静脉注射四氧嘧啶60 mg/kg，正常对照组注射生理盐水，72 h后断尾取血用葡萄糖氧化酶法测血糖，血糖值大于11.1 mmol/L的动物视为糖尿病动物。

(2)分组及给药 将动物按体重和血糖值均衡原则分成6组，每组12只，分为正常组、模型组、发酵饮品(JS5X 20、40、80 mL/kg)、二甲双胍(0.25 g/kg)组。正常组和模型组给予40 mL/kg溶媒，其余各组分别给予相应受试样品，每天灌胃给药1次(JS5X 80 mL/kg组按40 mL/kg每天灌胃给药2次)，共给药4周。每周观测体重、饮水/食量，给药4周测口服葡萄糖耐量(OGTT)。

1.3.3 调节血脂试验

发酵饮品对高脂血症大鼠血清总胆固醇(CHO)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)的影响。

健康雄性SD大鼠96只，按体重均衡原则随机分为6组，即正常组、模型对照组、阳性药对照组(非诺贝特20 mg/kg)，发酵饮品(JS5X 6.25、12.5、25 mL/kg)组，每组16只。除正常组外，其余各组大鼠每天(上午9:00)灌胃一次高脂乳剂(10 mL/kg)复制高脂血症模型。高脂乳剂配方(100 mL)：油相、猪油各20 g；胆固醇10 g；甲硫氧嘧啶 1 g，吐温-80为7 mL；水相、蔗糖各20 g；胆酸钠2 g；纯水适量。水相加入油相中混匀，蒸馏水定容至100 mL。

正常组和模型对照组灌胃给予0.5%CMC-Na(10 mL/kg)，阳性药对照组灌胃给予非诺贝特20 mg/kg，发酵饮品分别灌胃给予JS5X 6.25、12.5、25 mL/kg，每天(17:00)灌胃1次，共30 d。第30 d禁食12 h后，腹腔注射戊巴比妥钠(30 mg/kg)麻醉动物，腹主动脉取血，分离血清，用血脂四项联检试剂盒测定大鼠血清CHO、TG、LDL、HDL水平。

1.3.4 数据处理与分析

数据以均数±标准差表示，用student’st检验对实验数据进行分析，P<0.05认为有统计学差异。

2 结果与分析

2.1 核桃饼粕发酵所得饮品感官及理化评价

经上述发酵工艺所得饮品色泽红棕色，透光率90%，具有核桃三七花风味，产品酸甜适中。对制备得到的发酵饮品中基本成分及功能因子含量进行检测，其理化及功能指标见表1。不同发酵剂复合、发酵剂种类及工艺均会影响发酵饮品的活性组分含量以及抗氧化效果，采用上述发酵剂复合、发酵剂种类及工艺所得饮品最佳，所以采用该产品做调节血脂试验。

表1 发酵饮品生物活性成分及抗氧化力Tab.1 Bioactive ingredients and antioxidant power of mixed fermented beverage

2.2 发酵饮品对糖尿病小鼠血糖的影响

灌胃给予糖负荷后，模型组血糖水平显著升高，和正常组相比，差异显著(P<0.01)。阳性对照药二甲双胍给药4周能明显降低糖尿病动物OGTT 0、30、120 min血糖及血糖曲线下面积，和模型组相比，有显著差异(P<0.01)。发酵饮品40 mL/kg给药4周可以降低给糖后120 min血糖水平(和模型组相比，差异显著，P<0.05)，发酵饮品80 mL/kg给药4周明显降低糖尿病动物30 min血糖及血糖曲线下面积(和模型组相比，差异显著P<0.05)(表2)。

表2 JS5X对四氧嘧啶性糖尿病小鼠口服糖耐量的影响Tab.2 Effect of JS5X on oral glucose tolerance in alloxan induced diabetic mice

2.3 发酵饮品对高脂血症大鼠血清CHO、TG、LDL、HDL的影响

由表3可见，与正常组相比，模型组大鼠的血清CHO、TG、LDL、HDL水平均明显高于正常对照组(P<0.05)，提示高脂血症模型复制成功。与模型组相比，非诺贝特组大鼠血清CHO、LDL、HDL 均明显降低(P<0.05)。发酵饮品(JS5X 6.25、12.5、25 mL/kg)可显著降低高脂血症大鼠的CHO、LDL、HDL水平(与模型组相比，P<0.01)，并有一定的剂量效应关系，JS酵素(25 mL/kg)可显著升高高脂血症大鼠的TG水平(与模型组相比，P<0.05)。

表3 发酵饮品对高脂血症大鼠血清CHO、TG、LDL、HDL的影响Tab.3 Effects of fermented drinks on serum CHO,TG,LDL and HDL in hyperlipidemic rats

3 讨论与结论

3.1 讨论

云南是核桃(Juglanssigillata)主产大省，截至2020年底，云南省核桃栽培面积达286.87×104hm2、产量148×104t、产值412×108元。核桃产业已成为极具云南高原特色，在全国乃至世界有影响、有竞争力的优势产业[16-17]。核桃榨油后饼粕残留率高达70%，从饼粕中提取发酵原液率可达40%，以1 t发酵饮品原液现有市场价格5×104元/t计算，榨取1 t核桃果，可生产280 kg发酵原液，效益可达1.4×104元，即每吨核桃果提取发酵饮品可增加1.4×104元效益，如对全省核桃产量的5%进行榨油后酵素原液提取，效益可达5.95×108元[18]。

目前，云南核桃油脂加工企业主要开发核桃油系列产品，而将榨油后的核桃粕特别是带壳饼粕多作为饲料或燃料，核桃粕中大量的核桃蛋白资源不能充分利用，而随着植物蛋白资源高新技术的研究逐步深入，不断有新的蛋白产品推向市场。核桃饼粕蛋白不仅用于动物饲料和作物肥料，而且研发出了多种核桃蛋白新产品，如核桃植脂末、速溶蛋白粉、核桃代餐粉等，另外，也有一些核桃蛋白酸乳研制成功[19]，但未进行功效验证。通过添加不同辅料，本研究实现云南核桃精深加工产品多样化，从而提高经济附加值，突破云南核桃产业瓶颈问题。

3.2 结论

通过测定核桃饼粕发酵饮品中生物活性成分及抗氧化活力得最佳工艺配方，即按质量配比，核桃粕55～70 g，三七花6～8 g，饮用水400～600 g，枸杞2～3 g，红枣2～3 g，蜂蜜3～6 g，乳杆菌发酵剂0.2～0.4 g，低聚果糖8～10 g；乳杆菌发酵剂为嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、干酪乳杆菌以1︰2︰2混合的复合菌剂；核桃粕、三七花、枸杞、红枣、水、蜂蜜和乳杆菌发酵剂混合调配，然后在25～28 ℃发酵20 d；二次调配糖度为8%～9%。所得发酵饮品(80 mL/kg)可以改善四氧嘧啶性糖尿病小鼠口服糖耐量，对空腹血糖没有影响。所得发酵饮品具有辅助降低高脂血症大鼠血清总胆固醇的作用。高剂量发酵饮品具有降低高脂血症大鼠血清甘油三酯的作用。