丁酸盐与β-羟基丁酸盐在脊髓损伤中的抗炎作用

冯 婧， 刘建成， 张安仁

(1)成都中医药大学养生康复学院康复医学与理疗学专业， 成都 610075； 2)中国人民解放军西部战区总医院康复医学科， 成都 610083；3)同济大学附属上海市第四人民医院康复医学科， 上海 200080)

英国医学杂志《柳叶刀》研究显示，2016年全球脊髓损伤发病率、患病率和伤残损失寿命年率(years lost due to disability, YLD)分别为13/10万、368/10万和130/10万[1]。据国内学者统计，2017年中国创伤性脊髓损伤发病率、患病率和YLD分别为9.51/10万、340.10/10万和93.54/10万[2]。脊髓损伤的病理过程可分为2个阶段：原发性损伤和继发性损伤，前者是决定性的不可逆性的损伤，后者在一定时间内是可逆的，故治疗主要以减轻继发性损伤为主。目前，仍然未见有效的治疗脊髓损伤的方式。炎症反应是继发性损伤发展的主要原因，是影响脊髓损伤的病情和恢复的重要因素[3]。近年的基础研究发现，丁酸盐(Butyrate)治疗可防治多种疾病的炎症反应进展，包括牙周炎[4]、非酒精性脂肪性肝病[5]和结肠炎[6]等。其机制可能是：通过增加叉头框蛋白O3(forkhead box O3，FOXO3)的表达促进初始T细胞分化为调节性T细胞[7]，《自然》子刊的新研究证实，调节性T细胞可逆转炎症反应[8]；减少肠道中的活性氧从而减少核因子κB (nuclear factor kappa-B, NF-κB)活化[9]；抑制 NF-κB 信号通路的活性[10]；抑制组蛋白的去乙酰化及激活G蛋白偶联受体[11]；抑制 JAK-STAT 通路的活性，STAT1 的异常活性与炎症疾病有关[12]。β-羟基丁酸盐(β-Hydroxybutyrate或3-Hydroxybutyrate)是与丁酸盐密切相关的酮体代谢物，在痛风[13]和酒精性肝炎[14]等疾病中被证实可作为一种抗炎分子。β-羟基丁酸盐的抗炎作用主要通过抑制NLRP3炎性小体来实现[13, 15]，此外，也可能通过激活G蛋白偶联受体[14]，上调MAP3K8等抗炎因子及降低促炎基因α肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α, TNF-α)及白细胞介素(interleukin, IL)类IL-6和IL-12等的表达[16, 17]，抑制转录因子NF-κB的激活及JNK和AMPK蛋白磷酸化[17]等途径发挥抗炎作用。由此可知，丁酸盐与β-羟基丁酸盐具有相似的抗炎分子机制，故本文将两者放在一起讨论。丁酸盐与β-羟基丁酸盐的抗炎作用引起众多学者的关注。引起本文注意的是，已有研究证实：其可改善脊髓损伤后的炎症反应，但相关研究较少，且停留在基础研究层面。因此，本综述将通过回顾国内外文献，总结丁酸盐与β-羟基丁酸盐在脊髓损伤后炎症反应中的应用。

1 丁酸盐与β-羟基丁酸盐的结构与产生

1.1 丁酸盐的结构与产生

丁酸盐是一种4碳的短链脂肪酸(short chain fatty acids, SCFAs)，其分子式为CH3CH2CH2COOH(见Fig.1)，所有哺乳动物的肠道均会产生有限的丁酸盐。丁酸盐在维持肠道健康方面发挥关键作用[18,19]，它可以影响免疫调节[20]、细胞分化和凋亡[21]，同时也是结肠细胞的首选碳源[22]。已知有4种主要的丁酸盐产生途径，即乙酰辅酶 A(acetyl-CoA)通路、戊二酸(glutarate)通路、赖氨酸(lysine)通路和琥珀酸(succinate)通路(见Fig.1)。最普遍的是乙酰辅酶A途径，不易消化的碳水化合物产生丙酮酸(pyruvate)，丙酮酸发酵产生乙酰辅酶A，或由乳酸盐(lactate)产生。4种途径汇聚在中间产物巴豆酰辅酶A(crotonyl-CoA)，继而通过丁酸激酶(butyrate kinase, BUK)将丁酰辅酶A (butyryl-CoA)磷酸化形成的磷酸丁盐转化为丁酸盐，或通过丁酰辅酶A:乙酰辅酶A转移酶(butyryl-CoA:acetate-CoA transferase，BUT)基因将丁酰辅酶A直接转变为丁酸盐[23-25]。有很多细菌例如来自丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)、普拉梭菌(Faecalibacteriumprausnitzii曾经被命名为Fusobacteriumprauznitzii)、罗氏菌属(Roseburia)、真细菌(Eubacterium)、丁酸弧菌(Butyrivibrio)、粪厌氧菌(Anaerostipes)等菌属的细菌，能够在肠腔中产生mM水平的丁酸盐[26-29]。

1.2 β-羟基丁酸盐的结构与产生

哺乳动物生物体的能量代谢通常依赖于碳水化合物消化。当碳水化合物缺乏时，肝内线粒体自然产生酮体(包括β-羟基丁酸、乙酰乙酸和丙酮)作为能量燃料。其中，β-羟基丁酸盐占比超过70%。β-羟基丁酸盐的分子式为CH3CH(OH)CH2COOH，在其结构中包含1个丁酸核，与丁酸盐在结构上仅有1个羟基不同(见Fig.1)。β-羟基丁酸盐的合成途径(见Fig.1)：来自三羧酸循环(tricarboxylic acid cycle, TCA)的2个乙酰辅酶A分子，其通过β-酮硫解酶缩合为乙酰乙酰辅酶A (acetoacetyl CoA)，并通过乙酰乙酰辅酶A还原酶还原为3-羟基丁酰辅酶A(3-Hydroxy-3-metyloglutaryl-CoA)来直接合成β-羟基丁酸盐。有研究表明，除了主要来自肝内合成的β羟基丁酸盐外，动物体内的部分β-羟基丁酸盐来自微生物组产生的聚羟基丁酸的降解[30- 32]。

综上，丁酸盐与β-羟基丁酸盐结构具有相似性，有趣的是，两者似乎在代谢上也相互影响(见Fig.1)。有研究证实，注入丁酸盐可以增加动物体内的丁酸盐与β-羟基丁酸盐水平[33]，且后者随注入丁酸盐含量的增加而线性升高[34]。因此，将两者一起进行讨论是有意义的。

Fig.1 Synthesis paths of butyrate There are four main butyrate production pathways known. Apart from the most prevalent Acetyl-Coenzyme A (AcCoA) pathway, where AcCoA is produced via pyruvate derived from fermentation of host-indigestible carbohydrates (known as‘fibre’) or via lactate, there are three alternative synthesis pathways described, starting from glutarate, lysine, and succinate, which converge on the intermediate product crotonyl-CoA. The final step in butyrogenesis is the conversion of either butyryl-phosphate to butyrate by the butyrate kinase, encoded by the buk gene, or butyry-CoA to butyrate by the butyryl-CoA: acetate CoA-transferase, encoded by the but gene

2 丁酸盐、β-羟基丁酸盐与脊髓损伤炎症

炎症反应是造成脊髓继发性损伤的主要原因，在脊髓损伤的病理生理学发展过程中处于中心地位。脊髓损伤后急性期(受伤后 0 ～ 2 d)，巨噬细胞和中性粒细胞浸润到损伤部位以吞噬细胞碎片和髓鞘。活性氧(reactive oxygen species, ROS)激活小胶质细胞和星形胶质细胞，分泌白细胞介素(interleukin, IL)和更多ROS。在亚急性期(受伤后3 d至数周)，巨噬细胞和小胶质细胞处于M1表型并分泌维持促炎微环境的白细胞介素(IL-6、IL-12、IL-1β)和趋化因子(CCL2、CXCL2)。损伤区域还有 Th1 细胞，也可以分泌白细胞介素(IL-12、TNF-α、IFN-γ等)。在慢性期(受伤后7周至数年)，星形胶质细胞分泌抗炎性白细胞介素(IL-10、TGF-β)，将小胶质细胞和巨噬细胞转变为具有抗炎作用的M2型，通过分泌生长因子(脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)、神经生长因子(Nerve growth factor, NGF) 、表皮细胞生长因子(Epidermal Growth Factor, EGF)、睫状神经营养因子(Ciliary Neurotrophic Factor, CNTF) 、胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factors-1, IGF-1))和抗炎白介素(IL-13、IL-4、IL-10、TGF-β)发挥神经保护作用[35, 36]。动物研究表明，脊髓损伤的小鼠粪便中产丁酸盐菌Butyricimonas的水平显著降低，丁酸盐含量与假手术组相比，下降了58.6%[37]。产丁酸盐菌Butyricimonas丰度与β-羟基丁酸盐水平呈正相关[38]。临床数据显示，脊髓损伤患者体内产生丁酸盐的细菌Roseburia、Pseudobutyrivibrio、Dialister、Megamonas、Clostrdium和Faecalibacterium的丰富度明显低于健康人群[39- 41]。此外有研究表明，将健康小鼠的粪便菌群移植到脊髓损伤小鼠体内，可观察到受体小鼠的SCFAs明显上调(与对照组相比，FMT将粪便丁酸水平上调了46.7%)。同时发现，该菌群可以通过抑制 IL-1β/NF-κB 信号通路，减轻脊髓损伤小鼠的炎症反应，发挥神经保护作用[37]。脊髓损伤对小鼠血清和脊髓中β-羟基丁酸盐水平无显著影响。给予外源性β-羟基丁酸盐治疗后，脊髓损伤小鼠对β-羟基丁酸盐的利用率高于假手术组，部分创伤被逆转[42]。因此，丁酸盐、β羟基丁酸盐可能是用于治疗脊髓损伤的有前景的疗法。

3 丁酸盐、β-羟基丁酸盐在脊髓损伤中发挥抗炎作用的机制

3.1 对NF-κB/ NLRP3炎性小体信号通路的影响

NF-κB是介导脊髓损伤后炎症反应的核心[43]。抑制NF-κB和NLRP3炎性体的活化可以减轻脊髓损伤引起的炎症反应程度[44]。NF-κB激活主要通过IκB激酶抑制剂(inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase，IKK)介导的NF-κB抑制蛋白(inhibitor of NF-κB, IκB)的磷酸化而发生[45]。在脊髓损伤中，大量NF-κB调控的靶基因表达上调，包括α肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α, TNF-α)和白细胞介素例如IL-1β、IL-6和IL-8；趋化因子例如单核细胞趋化蛋白-1；黏附分子例如细胞间黏附分子-1和血管内皮黏附分子-1；诱导型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)、环加氧酶-2 (cyclooxygenase-2, COX-2)以及蛋白酶，例如基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)等[46]。IKK/NF-κB信号通路通过诱导炎症性细胞因子的释放，参与了脊髓损伤后活化的小胶质细胞的促炎作用的调控[47]。Lanza等[48]研究发现，丁酸钠治疗在脊髓损伤后24 h，抑制NF-κB的核活化及IκB-α降解，降低TNF-α、IL-1β、iNOS 和COX-2的表达。脊髓损伤后，活化的小胶质细胞可以激活NLRP3炎性小体，从而促进胱天蛋白酶1前体(pro-caspase-1)切割为具有活性的胱天蛋白酶1(caspase-1)，并引起IL-1β、NO和TNF-α等促炎因子增多，进一步扩大炎症反应和细胞凋亡[49]。有研究表明，产丁酸盐菌属的丰度与促炎基因表达呈负相关[50]。O’Connor等[51]的研究指出，脊髓损伤大鼠体内与丁酸产生有关的微生物随着IL-1β的增加而减少，特别是Faecalibacteriumprausnitzii。越来越多的证据证实，NLRP3的激活会导致IL-1β的释放。IL-1β是一种直接使伤害感受器敏感，并引起疼痛的炎性细胞因子，NLRP3被认为是炎性疼痛有巨大潜力的治疗靶点[52, 53]。Bayazid等[54]探讨了丁酸钠在TNF-α刺激的SH-SY5Y细胞中的神经保护作用机制。发现丁酸钠能减少NO的产生，降低iNOS和COX-2的表达，并抑制NLRP3炎性小体的活化。用β-羟基丁酸盐处理脂多糖(1 μg / mL)刺激4 h的人单核细胞的培养物，上清液中IL-1β和IL-18的含量随β-羟基丁酸盐浓度增加而依赖性减少[55]。Qian等[42]研究表明，在脊髓损伤小鼠中进行β羟基丁酸盐处理，可降低NLRP3蛋白表达，抑制胱天蛋白酶1的激活，减少IL-1β和IL-18的表达，减轻脊髓损伤后炎症反应。

3.2 抗氧化应激

脊髓损伤触发活性氧的产生，包括过氧化氢(H2O2)、超氧化物(O2-)和羟基(OH-)自由基等，ROS增加引发的氧化应激是重要的二次损伤因素[56]。氧化应激是一种重要的病理生理机制，可紧密地调节炎症反应[57]。越来越多的证据表明，NF-κB是能够被氧化应激激活的重要炎症转录调控因子[58]。H2O2和过氧亚硝酸盐被证实，可以正向或负向调节NF-κB的活性[59]。此外，核因子NF-E2相关因子(nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf2)是具有强抗氧化作用和抗炎作用的转录因子[60, 61]。因此，可以通过减少活性氧的生成来达到抗炎的目的。有报道指出，O2-、H2O2和脂质氧化终产物丙二醛(malondialdehyde, MDA)水平，在脊髓损伤动物模型损伤区域比假手术组更高, 抗氧化酶谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)表达降低[42, 62]。最新研究显示，丁酸钠通过Nrf2通路降低癫痫小鼠ROS水平，并提高抗氧化酶(CAT、SOD、GSH-Px)活性，表明丁酸钠能显著改善神经功能[63]。有学者发现，每日30 ～100 mg/kg剂量的丁酸钠治疗脊髓损伤小鼠会显著增加Nrf2表达，上调MnSOD的表达[48]。同时，β-羟基丁酸盐降低脊髓损伤小鼠O2-、H2O2和MDA的水平，并增强脊髓中SOD2和抗氧化分子过氧化氢酶(catalase, CAT)的转录，减轻氧化应激[42]。孔刚刚[64]研究发现，β-羟基丁酸盐通过抑制HDAC1和HDAC2，进而调节氧化应激相关蛋白FOXO3a、 NADPH氧化酶2(NADPH oxidase 2，NOX2)和NADPH氧化酶4(NADPH Oxidase 4，NOX4)表达，且证实β-羟基丁酸盐抑制NLRP3炎症小体的激活，参与调节脊髓损伤后小胶质细胞由促炎的M1型向具有神经保护作用的M2型转化。

3.3 其他

在大鼠脊髓损伤时立即给予持续7 d的丁酸钠600 mg/(kg. d)腹腔注射进行干预，损伤1周时，丁酸钠组脊髓组织的凋亡细胞和炎症细胞数显著少于对照组[65]。在脊髓损伤的Sprague-Dawley大鼠模型中，磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、磷酸化蛋白激酶B(Akt)和下游FOXO3a蛋白水平受到明显抑制[66]。Zhou等[67]在大脑中动脉闭塞大鼠模型中发现，丁酸钠的鼻内给药显著增加PI3K和Akt的表达，并减弱神经元凋亡。此外，用FOXO3a的腺病毒载体感染脂多糖诱导的脊髓细胞，会显著增加细胞中FOXO3a 蛋白水平，FOXO3a的过表达能降低TNF-α[66]。而β-羟基丁酸盐处理会显著增强脊髓损伤小鼠FOXO3a的表达[64]。因此，激活PI3K/ Akt /FOXO3a信号通路可能是丁酸盐和β羟基丁酸盐的抗炎机制之一。

4 丁酸盐、β-羟基丁酸盐的临床应用

目前，丁酸盐、β-羟基丁酸盐的临床干预已进展到外源性直接干预，相比内源性代谢途径更方便实施。外源性丁酸盐及β-羟基丁酸盐干预的安全性和耐受性已在临床试验中得到支持[68, 69]。两者的抗炎特性已经引起临床工作者的关注。炎症性肠病患者口服丁酸钠胶囊后发现，补充丁酸钠会增加具有潜在抗炎作用的细菌的生长[70]。志贺菌病期间用丁酸盐辅助治疗通过降低IL-1β和IL-8减轻炎症[71]。但是，两个独立的随机双盲安慰剂对照研究表明，当使用外源性酮补充剂升高血液β-羟基丁酸盐时，NLRP3的活化增强，外源性增加β-羟基丁酸盐可能增强炎症[72]。此外，Hamer等[73]研究表明，丁酸盐灌肠剂对结肠炎症和氧化应激的影响很小。综上所述，丁酸盐和β-羟基丁酸盐的抗炎作用在临床应用中具有争议性，还需要更多实验支持。

5 问题与展望

综上所述，现有的基础研究证实，丁酸盐及β-羟基丁酸盐在脊髓损伤后发挥抗炎作用，其机制可能涉及抑制NF-κB/ NLRP3炎性小体信号通路活性，以及抗氧化应激等多方面(见Fig.2)。目前，丁酸盐及β-羟基丁酸盐在脊髓损伤中的研究仅局限于体外实验和动物实验阶段，且相关研究较少，两者在其他疾病中的抗炎机制是否同样在脊髓损伤中也发挥作用仍需要更多研究来证明。此外，丁酸盐及β-羟基丁酸盐在临床中对炎症反应的治疗效果尚存在争议，在脊髓损伤中还未有相关数据，未来需进行更多探索。Cavaleri等[74]提出，β-羟基丁酸盐和丁酸盐在调节代谢、炎症、认知和一般健康方面具有潜在协同作用。从本文综述机制来看，β-羟基丁酸盐和丁酸盐可能存在协同性，预计两者结合用药可能更有效地达到治疗目标，这可能是未来研究的方向。

Fig.2 Anti-inflammatory mechanism of butyrate and β-hydroxybutyrate in a spinal cord injury Butyrate inhibits NF-κB activity and increases MnSOD and Nrf2 levels. β-hydroxybutyrate inhibits the NLRP3 inflammasome signaling pathway, enhances the expression of antioxidant molecules SOD2 and CAT, reduces reactive oxygen species generation and increases FOXO3 levels