SiO2NPs通过诱导氧化应激激活Fas/FasL通路促进TM4细胞凋亡*

2022-10-25王旭莹郭志义1郝会宇孙凡丽张品正孟芳宇陈紫云李金泽

生物化学与生物物理进展 2022年10期

王旭莹郭志义1，郝会宇孙凡丽张品正孟芳宇陈紫云李金泽尚璇**

（1）华北理工大学公共卫生学院，唐山 063210；2）华北理工大学基础医学院，唐山 063210；3）河北省慢性疾病基础医学重点实验室，唐山 063210）

纳米材料是指至少在一个维度测量不到100 nm，并表现出结构特征与生物、物理和化学相关的无机材料。由于纳米材料的尺寸接近电子的相干长度和光的波长，使得纳米材料表现出不同于其在宏观尺寸或整体状态时所展现的物理化学性质，如导电、光学和磁性等。纳米材料独特的性质使其在工农业生产和生活等领域有着相当大的应用潜力［1］。纳米硅（silica nanoparticles，SiNPs）作为全球生产最多、应用最广的纳米材料之一，其优良的物理化学性质和高度可调的生物相容性使其被广泛应用于食品工业［2］、美妆护肤和医疗领域，如生物分析、医学成像、生物标记和药物靶向输送［3-5］。研究表明，SiNPs可以通过消化道、呼吸道、皮肤等多种途径进入机体，并通过血液或淋巴循环系统到达潜在的敏感靶点。尽管每日暴露水平很低，但SiNPs在体内的清除非常缓慢，长期可导致在组织累积。而且，当材料的粒径达到纳米级时，理论上可进入机体并穿过体内的生物屏障到达微米材料所不能到达的区域。因此，原本无毒或低毒的材料当粒径达到纳米级时，毒性显著增强［4］，产生一系列致病作用［6］。生殖系统担负着将遗传信息传递给后代的重要使命，对外源性有害物质高度敏感。已有研究表明，纳米二氧化硅在体内暴露会影响雄性生殖系统，导致精子质量和数量下降［7］。然而，到目前为止，人们对纳米材料在生殖系统的毒性作用机制尚不清楚。

活性氧（reactive oxygen species，ROS）是一种高活性氧化自由基，包括超氧阴离子（O2-）、过氧化氢（H2O2）、过氧化基（ROO-）和羟基自由基（OH-）等［8］。在生理条件下，活性氧是细胞正常代谢的产物，参与多种信号通路的调控［9］。然而，当细胞内的抗氧化剂清除系统被过量的ROS消耗，导致氧化与抗氧化失衡，此时细胞发生氧化应激［10］。研究表明，纳米颗粒诱导的过量ROS可以引发DNA损伤、炎症、蛋白质变性和脂质过氧化，从而对细胞产生毒性作用。ROS的快速生成能激活肿瘤坏死因子受体超家族成员Fas受体［11-14］。Fas受体与死亡配体FasL结合后发生三聚化，进而被激活，使得Fas与其下游接头蛋白FADD结合形成蛋白质复合物作用于凋亡启动蛋白酶（Caspase-8），并进一步激活凋亡执行蛋白酶（Caspase-3，-6，-7），从而使细胞发生凋亡过程的级联反应［15］。据报道，约20%~88%的男性不育症患者精液ROS水平显著升高［16-18］。因此，纳米材料对生殖系统的毒性作用被认为可能与其诱导的氧化应激相关。N-乙酰基-L半胱氨酸（NAC）是一种含有巯基（-SH）的还原性物质，具有抗炎和抗氧化应激的药理效应，被广泛应用于临床呼吸系统、消化系统和心血管系统等疾病的治疗［19］。然而，NAC对纳米材料引起的氧化应激及生殖系统功能的影响尚不清楚。

据报道，SiO2NPs可以突破生殖屏障，分布在生精小管内的支持细胞和精母细胞中［20］。小鼠睾丸支持细胞在靠近生精小管基底部形成紧密连接复合体（tight junctions，TJs），将生精上皮分为基底小室（basal compartment）和近腔小室（abluminal compartment），各级生精细胞按照分化程度不同从基底小室向近腔小室依次有序排列。由于生精上皮内无毛细血管，近腔小室的各级生精细胞无法直接从血液获取营养物质，而是生活在支持细胞侧面胞质陷凹内，通过细胞间缝隙从支持细胞中获得激素和营养物质［21-22］。因此，深入探究外界有害因素对睾丸支持细胞的影响，对于更好地理解环境因素对男性生育力危害十分必要。TM4细胞来源于小鼠睾丸支持细胞，对药物非常敏感，可以间接反映环境毒物对精子发生的潜在毒性作用［23］。本研究以TM4细胞作为模型探讨SiO2NPs对小鼠睾丸支持细胞的毒性作用及其分子机制，旨在从细胞和分子水平探讨纳米材料对雄性生育力的影响，从而为避免生殖毒性、扩大纳米材料应用范围提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料

TM4专用培养基（武汉普诺赛，CM-0456）；0.25%胰蛋白酶（Hyclone，J2000-48）；纳米二氧化硅粉末（纯度为99.5%，分子粒径为5~20 nm，Sigma-Aldrich Chemical，637246）；抗氧化剂NAC（碧云天，ST1546）；CCK-8细胞增殖与活性检测试剂盒（北京聚合美，MF128-1）；ROS检测试剂盒（碧云天，S0033S）；丙二醛（malondialdehyde，MDA）测定试剂盒（南京建成，A001-3）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）测定试剂盒（南京建成，A003-1）；AnnexinⅤ-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒（美仑，MA0220）；FasL抗体（WL02999）购自万类生物；Fas抗体（AF5342）、Caspase-8抗体（AF6442）、Caspase-3抗体（AF6311）、Bax抗体（AF0120）、Bcl-2抗体（AF6139）和β-Actin抗体（AF7018）均为Affinity公司产品；辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的山羊抗兔IgG（A0208）或山羊抗鼠IgG（A0216）均购自碧云天公司；超敏ECL化学发光检测试剂盒（北京庄盟，ZD310A）。

1.2 方法

1.2.1 纳米二氧化硅电镜分析

透射电镜能够清晰地观察到纳米二氧化硅的形态和结构，而且直接简便地测量纳米颗粒的大小。将购买的商品化纳米二氧化硅溶于TM4专用培养基后使用超声波清洗机（新芝，SB4200D）超声，以使其分散均匀。在透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM）（JEOL，JEM-2800）下观察纳米二氧化硅的形态结构和粒径大小。

1.2.2 纳米二氧化硅的粒径分布及Zeta电位测定

将购买的商品化纳米二氧化硅用TM4专用培养基稀释为100 ng/L纳米二氧化硅悬液，使用超声波清洗机超声，以使其分散均匀。使用激光粒度仪/ZETA电位和纳米粒度分析仪（Malvern，Mastersizer2000/Zetasizer Mano zs90）检测纳米颗粒的粒径分布和Zeta电位。

1.2.3细胞培养

小鼠睾丸支持细胞TM4购于武汉普诺赛公司，常规培养于TM4细胞专用培养基中。细胞培养在37℃、5%CO2和饱和湿度条件下。每2 d根据细胞状态和密度进行换液或传代，取对数生长期细胞进行实验。

1.2.4 细胞增殖实验

将TM4细胞按密度为1×104个/孔接种于96孔板，置培养箱中培养24 h，待细胞贴壁后弃掉培养基，依次以终浓度为0、1、10、100 ng/L SiO2NPs培养液加入96孔板的各孔内，每个浓度设置3个平行。继续培养24 h后，弃掉培养基，加入含有CCK-8的培养基（10μl CCK-8和90μl培养基），培养箱内孵育2 h，然后每孔吸出100μl培养液至新的96孔板内，在酶标仪上于490 nm处测定每孔的光密度值A490。通过下列公式计算细胞存活率：细胞存活率=［（对照孔A490-实验孔A490）/（对照孔A490-空白孔A490）］×100%。实验重复3次取平均值。

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1.2.5 活性氧测定

TM4细胞处理同上，在SiO2NPs处理24 h后，弃掉培养基，加入含有终浓度10μmol/L的分子探针2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐（6-carboxy-2',7'-dichlofluorescein diacetate，DCFH-DA），培养箱内孵育30 min。弃掉培养基，用无血清培养基反复吹打并将细胞悬液转移至1.5 ml离心管中。用PBS清洗2次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。1 000 r/min离心5 min，加入100μl PBS重悬细胞。在488 nm激发波长，525 nm发射波长的条件下，使用荧光酶标仪（BioTek Instruments SynergyTMMx，美国）进行检测。实验结果以荧光值表示。

1.2.6 MDA及SOD测定

TM4细胞处理同上，在SiO2NPs处理24 h后，弃掉培养基，加入预冷的PBS反复吹打并将细胞悬液收集到1.5 ml EP管中。每管内加入200μl PBS重悬细胞，在冰上用电动组织研磨器研磨3~5 min。细胞悬液在12 000 r/min转速下离心10 min，将上清转移至新的1.5 ml离心管内作为蛋白质抽提液，蛋白质浓度采用BCA法测定。细胞内MDA含量和SOD活性测定按试剂盒说明书进行。MDA含量测定主要步骤如下：取100μl待测样本加入到含有100μl试剂一、1.5 ml试剂二应用液和1.5 ml试剂三应用液的15 ml离心管内，95℃水浴40 min，取出流水冲洗冷却，然后3 500 r/min转速下离心10 min，取200μl上清，在酶标仪上于532 nm处测定每孔的光密度值A532。SOD活性测定主要步骤如下：取20μl待测样本加入到含有20μl酶工作液和200μl底物应用液的1.5 ml离心管内，37℃温度孵育20 min后，在酶标仪上于455 nm处测定每孔的光密度值A455。通过下列公式计算SOD抑制率和活力：SOD抑制率=［（对照组A455-对照空白组A455）-（试验组A455-试验空白组A455）］/（对照组A455-对照空白组A455）×100%。SOD活力=SOD抑制率/50%×（反应体系/稀释倍数）/待测样本蛋白质浓度。实验重复3次取平均值。

1.2.7 Annexin V/PI凋亡测定

TM4细胞处理同上，在SiO2NPs处理24 h后，弃掉培养基，加入0.25%胰蛋白酶消化并将细胞转移至1.5 ml离心管内。用预冷的PBS清洗细胞2次，1 000 r/min转速下离心5 min，加入含有5μl PI和5μl Annexin V-FITC的500μl染色缓冲液重悬细胞，室温避光孵育15 min。使用FACSCalibur流式细胞仪（美国BD公司）在488 nm激发波长，530 nm发射波长条件下进行检测，每组样本共收集30 000个细胞。数据使用BD CELLQuest Pro软件（美国BD公司）进行分析。试验结果分为4个部分：UL（左上），Annexin V阴性而PI阳性的细胞群，代表细胞碎片；UR（右上），Annexin V和PI双阳性的细胞群，代表晚期凋亡细胞；LL（左下），Annexin V和PI双阴性的细胞群，代表活细胞；LR（右下），Annexin V阳性而PI阴性的细胞群，代表早期凋亡细胞。

收集TM4细胞至1.5 ml离心管后，预冷PBS洗涤3遍，1 000 r/min转速下离心5 min。加入200μl含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，在冰上用电动组织研磨器研磨3~5 min后静置30 min。细胞悬液在12 000 r/min转速下4℃离心20 min，转移上清至新的离心管内作为蛋白质抽提液。使用BCA法进行蛋白质浓度测定。在等量蛋白中（20μg）加入蛋白质上样缓冲液，100℃温度下煮沸5 min使蛋白质变性。变性后的蛋白质经SDS-PAGE电泳（5%浓缩胶，10%分离胶）分离后，湿转90 min至PVDF膜上。PVDF膜用5%脱脂牛奶室温封闭1 h后，在4℃条件下孵育一抗（1∶1 000）过夜。用PBST漂洗3次后，与山羊抗兔或抗鼠IgG二抗（1∶10 000）室温孵育1 h。用PBST漂洗3次，每次10 min。配置ECL化学发光试剂，混匀后滴在PVDF膜上，使用化学发光成像系统（ChemiScope 6100 EXP）拍照。

1.2.9 统计学分析

使用SPSS 19.0软件，采用单因素方差分析和t检验等方法分析数据，计量资料以均数±标准差表示。实验至少重复3次，P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SiO2NPs的分子表征

利用TEM观察可见，纳米二氧化硅单粒形态呈球形，分子粒径约10 nm，但易聚集成团（图1a）。进一步利用Zetasizer仪器分析了纳米二氧化硅在细胞培养基中的分散性和Zeta电位，结果表明纳米二氧化硅的粒径分布包括10.04、50.07和439.6 nm（图1b），Zeta电位平均值为-25.7 mV（表1），提示纳米二氧化硅在细胞培养基中稳定性较差，易发生聚集。

Table 1 Zeta potential(pH=7.0)of SiO2NPs in medium

2.2 SiO2NPs显著抑制TM4细胞的生长和增殖

光学显微镜下（40×）可见，对照组TM4细胞呈上皮样贴壁状况良好，形态呈梭形或多角形，细胞核明显。而在SiO2NPs（1、10、100 mg/L）处理24 h后，TM4细胞数量下降，胞体变小、变圆，细胞间连接结构显著减少，在100 mg/L组可见少量细胞碎片（图2a）。为进一步明确SiO2NPs对TM4细胞活性的影响，利用CCK-8法测定不同浓度SiO2NPs处理后TM4细胞的存活率。如图2b所示，1、10和100 mg/L SiO2NPs处理对TM4细胞存活率的抑制作用与对照组相比均有显著差异（P<0.05），分别下降至84.8%、88.5%和61.4%。结果表明，随处理剂量的增加，SiO2NPs可明显抑制TM4细胞的生长和增殖，并造成细胞结构损伤。

2.3 SiO2NPs诱导TM4细胞发生氧化应激

为研究纳米二氧化硅影响TM4细胞活性的作用机制，利用反映氧化应激状态的标志分子（ROS、MDA和SOD）试剂盒检测了SiO2NPs暴露24 h后TM4细胞中的氧化应激水平。如图3所示，随着SiO2NPs处理剂量的增加，TM4细胞中ROS和MDA含量以及SOD活性显著升高。这些结果表明，纳米二氧化硅可以诱导ROS产生，使TM4细胞内氧化还原系统失衡，进而引起氧化应激。

2.4 SiO2NPs激活TM4细胞内Fas/FasL介导的凋亡信号通路

过度氧化应激可以引发细胞凋亡。利用Annexin V-FITC和PI对不同浓度SiO2NPs处理的TM4细胞进行染色后，通过流式细胞仪分析。结果表明，SiO2NPs可以显著增加凋亡细胞的比例，表现为剂量依赖性（图4a，b）。此外，利用Western blot检测Fas/FasL介导的凋亡信号通路相关分子在不同处理组TM4细胞的蛋白质表达情况，结果显示，SiO2NPs处理显著上调Fas/FasL调控的促凋亡相关分子蛋白质表达水平（Fas、FasL、Caspase-8、Caspase-3和Bax），并降低抗凋亡分子Bcl-2蛋白水平（图4c，d）。

2.5 抗氧化剂NAC缓解SiO2NPs诱导的细胞内氧化应激水平

为进一步明确氧化应激与SiO2NPs引起的细胞毒性的关系，利用抗氧化剂NAC与100 mg/L SiO2NPs联合处理TM4细胞。结果表明，NAC可以有效抑制SiO2NPs引起的氧化应激，表现为ROS和MDA含量以及SOD活性的下降（图5）。

2.6 抗氧化剂缓解SiO2NPs诱导的细胞损伤和细胞凋亡

光学显微镜下可见，抗氧化剂NAC和100 mg/L SiO2NPs联合处理组与单一处理100 mg/L SiO2NPs组相比，细胞数量和细胞间连接结构显著增多，细胞形态恢复上皮样结构（图6a）。进一步研究发现，NAC和SiO2NPs联合处理可以显著缓解SiO2NPs诱导的细胞凋亡（图6b，c）。

3 讨论

睾丸支持细胞参与精子发生过程的启动和维持，支持细胞的异常变化与精子发生障碍和男性不育密切相关［22，24］。基于实施难度和伦理道德等多方面综合考虑，在过去的几十年中，毒理学的研究重点已经逐渐从基于动物的实验转变为体外研究。在诸多研究环境因素与男性生育力关系的模型中，TM4细胞系是应用最为广泛的体外模型。TM4细胞在体外培养时持续表达睾丸支持细胞特有的一些标志分子，例如分泌转铁蛋白和纤溶酶原激活物，同时表达雄激素和雌激素受体，对卵泡刺激素也有一定反应［25］。因此，本研究以TM4细胞为模型，研究纳米材料对雄性生殖系统的毒性作用及其机制。

在本研究中，细胞增殖实验显示TM4细胞存活率随SiO2NPs浓度增高而逐渐下降，表明SiO2NPs对TM4细胞生长和增殖有显著抑制作用。显微镜视野下处理组TM4细胞数量下降，形态皱缩以及细胞间连接结构的减少进一步证实SiO2NPs可以引起TM4细胞损伤。已有研究表明，由于活性表面存在抗氧化剂功能基团，纳米材料可以直接诱导ROS和自由基的产生，当细胞内的氧化还原状态失衡会导致氧化应激。为明确TM4引起细胞损伤的机制，本文检测了ROS、SOD和MDA等直接或间接反映细胞内氧化还原状态的分子指标。ROS是机体内产生的含氧并且性质活泼的物质的总称，生理条件下主要来自于线粒体呼吸过程中生物氧化的副产物。正常情况下，细胞内的抗氧化系统还原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）和抗氧化酶类（GSH-PX，SOD）可清除ROS，保护细胞免受损伤。当体内ROS的产生与细胞内抗氧化防御系统失衡时，就会发生氧化应激［26］。MDA是ROS攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFA），引发脂质过氧化作用而形成的脂质过氧化产物。检测MDA的含量可以反映细胞内脂质过氧化程度，间接地反映细胞损伤的程度。本研究发现，SiO2NPs可以显著增加TM4细胞中ROS和MDA的含量以及抗氧化酶SOD的活性。结果提示，纳米二氧化硅可能通过破坏ROS和抗氧化防御系统的动态平衡而诱导小鼠TM4细胞发生氧化应激。

持续的氧化应激导致DNA损伤，当DNA损伤严重到无法修复时会可启动细胞凋亡或衰老等信号通路［27］。据报道，纳米材料可以通过多种途径介导细胞凋亡。在冠心病细胞中，SiNPs通过调控miR-22小分子RNA的表达激活Wnt-1信号通路介导细胞凋亡［28］。在肺泡巨噬细胞中，SiNPs通过激活PI3K/Akt信号通路介导细胞凋亡［29］。本研究发现，SiO2NPs可以显著增加TM4细胞凋亡率并激活Fas/FasL介导的细胞凋亡信号通路［30-31］。多项研究表明，纳米材料的细胞毒性作用可能与其诱导产生的ROS和氧化应激密切相关。为进一步阐明纳米材料在TM4细胞产生毒性作用的分子机制，使用抗氧化剂NAC对SiO2NPs处理细胞进行了挽救治疗。NAC是一种抗氧化剂和自由基清除剂，被广泛应用于临床疾病的治疗，然而其对生殖系统的保护作用目前尚未有报道。在本研究中，将NAC和SiO2NPs联合处理后可以显著缓解SiO2NPs造成的细胞损伤、氧化应激和细胞凋亡。这些结果表明，SiO2NPs通过诱导氧化应激激活Fas/FasL信号通路促进TM4细胞凋亡，而该过程可以被抗氧化剂NAC阻断（图7）。