木香烃内酯对肝癌SMMC-7721细胞凋亡的影响及其作用机制

刘丹，张永慧，何秀贞，熊书，马羚，冯彬彬，冯晓灵

重庆三峡医药高等专科学校三峡库区道地药材开发利用重庆市重点实验室，重庆 404020

原发性肝癌分为肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）、肝内胆管癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC）和HCC-ICC混合型。HCC占原发性肝癌的85%～90%［1］。肝癌的治疗方式包括手术、局部消融、介入疗法、放疗及系统治疗［2］。由于HCC发病隐匿，易转移，大部分患者就诊时已失去手术时机，因此，探索治疗HCC的新药物成为基础和临床研究热点之一。

木香（Aucklandiae radix）为菊科植物，具有行气、止痛、健脾、消食的功效［3］。木香烃内酯（costunolide，Cos）是从木香植物中提取的一种倍半萜类内酯化合物，具有抗炎、抗氧化、抗过敏、抗微生物等作用［4-6］。有研究显示，Cos通过激活凋亡和自噬途径，产生活性氧（reactive oxygen species，ROS）、cleaved caspase-3和cleaved caspase-9，来抑制人卵巢癌细胞的生长［7］；体内和体外试验证明，Cos通过线粒体途径诱导人胃腺癌BGC-823细胞的凋亡［8］，还可通过内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）介导IRE1α-JNK的激活，诱导肺癌A549细胞发生线粒体途径凋亡［9］。另有研究表明，ERS与HCC的发生发展密切相关［10］，Cos在诱导肝癌细胞凋亡中的作用尚未明确。因此，本研究通过流式细胞术及Western blot法检测Cos对人肝癌SMMC-7721细胞凋亡的影响，探讨其作用机制与ERS通路的相关性。

1 材料与方法

1.1 细胞 肝癌SMMC-7721细胞购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

1.2 主要试剂Cos购自上海源叶生物科技有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒（增强型）、RIPA裂解液（强）及PMSF（100 nmol／L）均购自上海碧云天生物技术有限公司；DMSO购自美国Sigma公司；RPMI1640培养基及胎牛血清均购自美国Gibco公司；细胞凋亡试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司；小鼠抗Bcl-2、Bax、Caspase-3、GRP78、CHOP、ATF4及β-actin单克隆抗体均购自美国Santa Cruz公司；HRP标记的山羊抗小鼠IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 细胞培养及分组 参考文献［11-12］方法，将SMMC-7721细胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液，于37℃，5%CO2细胞培养箱中培养，每隔2～3 d进行1次传代。取第2代对数生长期的SMMC-7721细胞，随机分为对照组及10、20、30 μmol／L Cos剂量组，于37℃，5% CO2细胞培养箱中培养24 h。

1.4 Cos对人肝癌SMMC-7721细胞凋亡影响的检测采用流式细胞术。取各组SMMC-7721细胞，按每孔106个接种至6孔板，于37℃，5% CO2细胞培养箱中培养48 h；收集细胞，用预冷PBS洗涤3次，Binding Buffer重悬，加入Annexin V-FITC，混匀，于室温避光孵育10 min；100×g离心5 min，取沉淀，用190 μL Binding Buffer重悬细胞，加入10 μL PI，4℃避光孵育15 min，立即用流式细胞仪进行检测，试验重复3次。应用FlowJo V10软件进行分析，以处于早期和晚期凋亡细胞所占总细胞数的比例为细胞凋亡率（apoptosis rate，AR）。

1.5 Cos对人肝癌SMMC-7721细胞中凋亡相关蛋白表达水平影响的检测 采用Western blot法。取各组SMMC-7721细胞，RIPA裂解液提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。经12.5% SDS-PAGE分离蛋白后，电转移至PVDF膜，用封闭液（含Tween 20的Tris-HCl，pH 8.0）于室温封闭10 min；加入小鼠抗Bcl-2、Bax、Caspase-3及β-actin单克隆抗体（均1∶1 000稀释），4℃孵育过夜；用TBST洗涤3次，加入HRP标记的山羊抗小鼠IgG（1∶3 000稀释），37℃摇床孵育1 h；用TBST洗涤3次，ECL法显色。试验重复3次。

1.6 Cos对人肝癌SMMC-7721细胞中ERS通路相关蛋白表达水平影响的检测 取对照组、10及20 μmol／L Cos剂量组SMMC-7721细胞，采用Western blot法检测细胞中GRP78、CHOP、ATF4的表达水平，其中一抗为小鼠抗GRP78、CHOP、ATF4（均1∶1 000稀释）及β-actin（1∶3 000稀释）单克隆抗体，其他检测步骤同1.5项。

1.7 统计学分析 应用GraphPad Prism 5软件进行统计学分析，所有数据均采用均值±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Cos对SMMC-7721细胞凋亡的影响10、20和30 μmol／L Cos剂量组及对照组SMMC-7721细胞AR分别为（6.73±1.26）%、（33.09±4.17）%、（80.75±1.23）%和（4.31±0.23）%。10、20和30 μmol／L Cos剂量组SMMC-7721细胞AR均明显高于对照组（t分别为2.682、9.744、86.78，P均＜0.05）；各Cos剂量组SMMC-7721细胞AR随剂量的增加而上升，且差异有统计学意义（t分别为8.556和59.61，P均＜0.01）。见图1。表明Cos可诱导SMMC-7721细胞凋亡，且呈剂量依赖性。

图1 流式细胞术检测Cos对SMMC-7721细胞凋亡的影响Fig.1 Flow cytometry of effect of Cos on apoptosis of SMMC-7721 cells

2.2 Cos对SMMC-7721细胞凋亡相关蛋白表达水平的影响 与对照组比较，20和30 μmol／L Cos剂量组SMMC-7721细胞中Bcl-2蛋白表达水平明显降低（t分别为3.060和3.935，P均＜0.05），Bax蛋白表达水平均明显增加（t分别为3.578和3.666，P均＜0.05），10 μmol／L Cos剂量组的Bcl-2及Bax蛋白表达水平差异无统计学意义（t分别为1.121和1.158，P均＞0.05）；各Cos剂量组SMMC-7721细胞中Caspase-3蛋白表达水平差异无统计学意义（t分别为0.785、1.786、2.345，P均＞0.05）。见图2和图3。表明Cos可上调人肝癌SMMC-7721细胞Bax的表达，下调Bcl-2表达，诱导SMMC-7721细胞凋亡。

图2 Western blot法检测Cos对SMMC-7721细胞中Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表达的影响Fig.2 Western blotting of effect of Cos on expressions of Bax，Bcl-2 and Caspase-3 proteins in SMMC-7721 cells

图3 各组SMMC-7721细胞中Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白的表达水平Fig.3 Expression levels of Bax，Bcl-2 and Caspase-3 proteins in SMMC-7721 cells of various groups

2.3 Cos对人肝癌SMMC-7721细胞中ERS通路相关蛋白表达水平的影响 与对照组比较，10、20 μmol／L Cos剂量组SMMC-7721细胞中GRP78、CHOP、ATF4蛋白的表达水平均明显升高（t分别为2.837～6.054，P均＜0.05），见图4和图5。

图4 Westernblot法检测Cos对SMMC-7721细胞中GRP78、CHOP、ATF4蛋白表达的影响Fig.4 Western blotting of effect of Cos on expressions of GRP78，CHOP and ATF4 proteins in SMMC-7721 cells

图5 各组SMMC-7721细胞中GRP78、CHOP、ATF4蛋白的表达水平Fig.5 Expression levels of GRP78，CHOP and ATF4 proteins in SMMC-7721 cells of various groups

3 讨论

木香是抗癌复方中常使用的一味中药，其抗肿瘤作用的有效成分为Cos及去氢木香内酯（dehydrocostus Lactone，DL）。Cos对多种肿瘤细胞具有诱导凋亡的作用，如Cos通过激活丝裂原活化蛋白激酶和产生ROS，增强阿霉素诱导的前列腺癌细胞凋亡［13］。有研究表明，Cos和DL联合用药可通过c-Myc／p53和AKT／14-3-3信号通路诱导乳腺癌细胞周期阻滞和凋亡［14］。

目前，关于Cos抑制人肝癌SMMC-7721细胞的研究较少，且分子机制尚未明确，因此本研究探讨了Cos对肝癌SMMC-7721细胞的影响及潜在的分子作用机制。本研究将SMMC-7721细胞分为对照组及10、20、30 μmol／L Cos剂量组，流式细胞术检测结果显示，10、20和30 μmol／L Cos作用SMMC-7721细胞48 h可显著提高细胞凋亡率（P＜0.05），且呈剂量依赖性；Western blot检测结果表明，与对照组比较，20和30 μmol／L Cos组SMMC-7721细胞中Bcl-2表达水平明显降低（P＜0.05），Bax蛋白水平均明显升高（P＜0.05），Caspase-3差异无统计学意义（P＞0.05）。提示Cos可诱导SMMC-7721细胞凋亡。有研究已证实，槲皮素通过激活p-STAT3／Bcl-2通路诱导ERS进而触发卵巢癌细胞凋亡和自噬［15］；Cos还可通过活性氧介导的ERS和JNK途径诱导人U2OS细胞凋亡［16］。提示Cos诱导的ERS参与了细胞凋亡。本研究结果显示，Cos作用SMMC-7721细胞48 h后，GRP78、CHOP、ATF4表达明显上调（P＜0.05），Cos促进SMMC-7721细胞凋亡可能是通过ERS途径诱导实现的。

综上所述，Cos可通过激活ERS通路促进肝癌细胞SMMC-7721凋亡，这可能是一种新的抗肝癌细胞的作用机制，但Cos对肝肿瘤动物模型的作用还需进一步研究。本研究为Cos用于肝癌的临床治疗提供了实验依据。