草莓叶片不同保存方法对RT-PCR 检测草莓斑驳病毒效果的影响

白莹雪，李 杨，祝 宁，张家兴，任俊达*，尚巧霞*

(1. 北京农学院农业农村部华北都市农业重点实验室，北京 102206；2. 北京市昌平区十三陵林场，北京102200；3. 北京市昌平区农业技术推广站，北京 102200)

草莓是蔷薇科（Rosaceae）草莓属（Fragaria）多年生宿根草本植物[1]。草莓病毒在世界各草莓栽培区广泛分布，由于草莓生产主要依靠匍匐茎进行无性繁殖，而病毒可随无性繁殖材料和传毒介体传播扩散，故严重影响草莓的产量和品质，这也成为了草莓生产中最主要的威胁[2-6]。草莓斑驳病毒（SMoV）是伴生豇豆病毒科（Secoviridae）温州蜜柑矮缩病毒属（Sadwavirus）的未确定种，是一种侵染草莓的潜隐性RNA 病毒。病毒粒子为球形，通常存在于植株叶片的表皮细胞、薄壁细胞和韧皮部细胞。1938 年第一次在英格兰凤梨草莓上发现，目前在世界各草莓栽培区均有分布[7-9]。在RNA 病毒检测过程中，获得高质量的样本总RNA 是一切试验的基础。因此，建立简便、有效的草莓叶片保存方法，对草莓斑驳病毒的检测结果影响巨大，对该病毒的科学研究和有效防控也具有重要意义。目前，对于草莓斑驳病毒的检测研究仍以RT-PCR 技术为主，其灵敏度高且操作较简便[10-14]。应用RT-PCR 技术检测草莓SMoV 时发现，若不及时进行检测，所提取的总RNA 容易降解[15]。若样本保存不当，PCR 检测效果显著降低，所以病样材料保存质量的高低是开展分子检测的基础。如果条件允许，要尽量选择新鲜的植物组织，病毒RNA 质量相对较高。但是在实际检测过程中，受限条件较多。有时病样采集地区偏远，需要3～5 d 的物流运输过程，再加之天气炎热等原因，很难保证试验前的样本仍然具有高质量的RNA，因此，筛选简便可行的样品保存方法十分重要。现有研究多关注于不同保存方法对植物基因组RNA 提取效果的影响。不同干燥保存条件适用的植物种类和植物部位不同[16-22]。干燥保存方式大多以压干、硅胶干燥、微波干燥、烘干和自然晾干为主，但不同保存方法对植物组织中病毒的PCR 检测效果有何影响尚鲜见报道。本研究先采用不同干燥方法保存SMoV 阳性草莓叶片，包括自然风干、硅胶干燥和氧化钙（CaO）干燥保存方法，筛选出最佳干燥保存技术后，再与几种常见的低温保存方法比较，探究最适宜的保存条件，确立一种方便可行的草莓叶片样本保存方式，以期达到最好的病毒检测效果，为植物病毒检测提供理论依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

试验材料：样本采集于北京市昌平区草莓种植棚内，经RT-PCR 检测感染SMoV 的草莓叶片放置于冰箱保存备用。

试剂： EASY spin 植物RNA 快速提取试剂盒（北京艾德莱生物科技有限公司）、CaO（国药集团化学试剂有限公司，分析纯）、变色硅胶（青岛海洋化工有限公司）、2×TaqPCR Mix（北京爱博森生物科技有限公司）和琼脂糖（北京爱博森生物科技有限公司）。

1.2 不同方法保存草莓叶片样本

将经过RT-PCR 检测为SMoV 阳性草莓叶片平均分为9 份，每3 份为1 个处理。处理1：采用自然风干法保存[19]；处理2: 将样本放置于含有0.5 g硅胶颗粒的密闭容器中保存[19]；处理3：将样本放置于下部铺有0.5 g CaO 粉末的密闭容器中保存。在室温条件下干燥处理1、3 和7 d。比较各处理样本提取的总RNA 浓度、反转录合成的cDNA 浓度以及RT-PCR 检测效果，然后从中再选取RNA 提取效果最好的干燥方法与其他5 种最常见保存方式进行比较。这些5 种处理方法分别为：将等量叶片样本放置在25 ℃室温下自然晾干保存；将样本放置于烘箱中，50 ℃干燥2 min 后，再25 ℃室温保存；将样本存放于4 ℃冰箱中保存；将样本存放于-20 ℃冰箱中保存；将样本存放于-80 ℃冰箱中保存以及采用上述最佳干燥方法保存。处理时间分别为5、10、15、20 和30 d。

1.3 RNA 提取

按照EASY spin 植物RNA 快速提取试剂盒（北京艾德莱生物科技有限公司）说明书提取。

1.4 RNA 浓度测定

按照1.3 方法提取草莓样本总RNA，使用Thermo NanoDrop 2000微量紫外分光光度计测定每份样品总RNA 浓度，计算3 次重复的平均值。

1.5 RT-PCR 检测

反转录：将11 μL DEPC 水、1 μL 反向引物（SMoV6732R：5'-CAGGTTACTCTAGTACGTCAC CAC-3'）、2 μL dNTP 和1.5 μL RNA 混匀后，65 ℃水浴5 min，冰浴5 min，之后再分别加入4 μL M-MLV Buffer，0.5 μL M-MLVRT、0.5 μL Recombinant RNase Inhibitor，涡旋离心后，经过42 ℃ 1 h、和72 ℃ 15 min，得到cDNA。使用Thermo NanoDrop 2000 微量紫外分光光度计测定cDNA 浓度，记录3 次重复平均值。

PCR 扩增：采用正向引物（SMoV6126F：5'-GGTTTGAAGGAATAGGGTTGTTG-3')与反向引物（ SMoV6732R: 5'-CAGGTTACTCTAGTACGTCA CCAC-3'）进行PCR 扩增。反应体系为25 μL：引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL；2×TaqPCR Mix 12.5 μL；cDNA 2 μL，加ddH2O 水至25 μL。扩增程序为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，35 个循环；72 ℃ 5 min。取5 μL PCR 产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，紫外凝胶成像检测。

2 结果与分析

2.1 3 种干燥方法保存效果分析

SMoV 阳性草莓叶片经不同干燥保存条件保存1、3 和7 d 后，进行样本总RNA 提取，反转录合成cDNA 第一链，并使用Thermo NanoDrop 2000微量紫外分光光度计测定浓度。将不同方法3 次重复所测得总RNA 浓度和反转录所得cDNA 浓度取平均值，结果如图1 所示。由图1(a)可以看出，在1、3 和7 d 时自然风干保存叶片总RNA 浓度分别为297.8、229.0 和133.9 ng·μL-1；硅胶干燥保存叶片总RNA 浓度分别为311.7、242.3 和164.7 ng·μL-1；CaO 干燥保存叶片总RNA 浓度分别为457.1、432.8和422.8 ng·μL-1。由图1(b)可以看出，在1、3 和7 d时自然风干保存叶片cDNA浓度分别为408.0、395.2和349.8 ng·μL-1；硅胶干燥保存叶片cDNA 浓度分别407.2、398.5 和382.8 ng·μL-1；CaO 干燥保存叶片cDNA 浓度分别为513.5、495.1 和479.2 ng·μL-1。由此可知，CaO 干燥保存条件效果最好且较稳定，RNA 浓度和cDNA 浓度均明显高于其他两种处理，且随着保存天数的增加，RNA 和cDNA 浓度变化不大。另外两种方法中，硅胶干燥保存效果次之，自然风干保存效果最差。

图1 不同干燥保存方法提取SMoV 阳性草莓叶片 RNA 和反转录cDNA 浓度的变化Figure 1 Variations of RNA and reverse transcription cDNA concentrations in SMoV positive strawberry leaves extracted by different drying treatments

将3 种干燥处理后提取的总RNA 进行特异性反转录，获得cDNA。RT-PCR 检测发现（图2），从CaO 干燥处理后的草莓叶片样品提取的总RNA均可扩增出清晰的目的条带。随着保存时间的增加，从自然风干和硅胶干燥处理的样品扩增条带亮度逐渐变暗甚至消失。因此，CaO 干燥是保存草莓叶片提取总RNA 的最佳方法。

图2 3 种叶片干燥保存方法对SMoV RT-PCR 检测效果比较Figure 2 Comparison of SMoV RT-PCR detection effects among three methods of leaf dry preservation

2.2 RT-PCR检测不同方法保存草莓叶片SMoV的效果比较

上述试验证实，CaO 保存为其中最好的干燥保存方法。为了将它与几种最常见的叶片保存方式进行比较，进行了25 ℃室温保存、烘箱干燥、CaO干燥、4 ℃、-20 ℃和-80 ℃这6 种不同处理下SMoV 的RT-PCR 检测分析。结果（图3）表明，随着时间的推移，即使到了第30 天，CaO 干燥保存后的叶片依旧能扩增出清晰的目的条带。而其他几种方法扩增条带较暗淡，扩增产物量少甚至逐渐消失。因此，CaO 干燥保存效果最佳且稳定。

图3 不同方法保存草莓叶片对SMoV RT-PCR 检测效果比较Figure 3 Comparison of SMoV RT-PCR detection effects in strawberry leaves preserved by different methods

3 讨论与结论

草莓成熟叶片中含有大量多糖和多酚类物质[23]，这些杂质含量高而难以获得高质量的RNA。植物多糖能够抑制多种生物酶的活性且理化性质与RNA 接近，多糖还能与核酸、蛋白质、多酚类物质结合，是影响RNA 提取的重要因素[24-25]。多糖相对较易清除，目前已有多种清除效果显著的方法，而多酚是植物抵御逆境胁迫产生的重要次级代谢产物，因具备较强氧化和络合能力而不易被有效清除。在RNA 提取过程中，应该重点排除多酚对RNA 提取试验的影响。本试验利用试剂盒提取草莓叶片RNA 的效果较好，但后续试验还应进一步优化，合理使用多酚螯合剂等方式，以获得更高质量的RNA。

样品保存是病毒检测的物质基础，目前多采用新鲜或冷冻材料。如需野外远距离运输，新鲜叶片容易萎焉甚至腐烂，样本RNA 易降解。而携带液氮、干冰或冰袋冻存植物材料会增加检测成本。另外，离体草莓叶片中的RNA 病毒极易受RNA 酶的作用而降解[26]。因此，研究感病植物样本的有效保存方法具有重要意义[27]。

PCR 扩增是分子生物学研究的重要手段，灵敏度高且方便快捷，但病毒RNA 不稳定、易降解，且草莓植株中病毒含量极低。野外采集样本常受客观条件限制，不能在现场及时进行病毒检测，样品送检过程时间较长，甚至需要长距离物流运输过程，此类情况均涉及样品保存时间长短问题。课题组在多年草莓病毒检测过程中发现，普通保存方法无法保证长期保存离体草莓带毒叶片的质量，SMoV 检测效率较低。因此，研究简便、快捷和高效的草莓样本保存方法对后续病毒检测具有重要意义。

不同保存方法对寄主植物组织中病毒RNA 提取和RT-PCR 检测效果的影响尚未见报道。本试验比较分析了不同保存方法对基因组RNA 浓度和反转录cDNA 浓度的影响，可以确定不同方法保存的试验材料具有不同研究层次的适用性。研究结果表明，CaO 干燥保存草莓叶片对RT-PCR 检测SMoV效果最好，原因可能是密闭环境下CaO 与草莓叶片呼吸作用释放出的水分相结合，达到脱水效果。没有水分的存在，RNA 酶无法水解叶片中的RNA，从而抑制叶片中RNA 的降解。长距离野外采样可采用CaO 干燥保存样品，此方法可明显提高保存效果并降低保存成本，本研究结果不仅可以提高草莓斑驳病毒的PCR 检测效率，还对病毒资源的长期有效保存具有重要意义。

CaO 干燥保存与其他几种常见保存方式相比，RT-PCR 检测SMoV 效果最好且操作简单、成本低。此研究适用于高效、便捷检测草莓叶片中的SMoV，可广泛应用于田间大量草莓样本的采集，提高感病草莓病毒检测效率。