化妆品中人表皮生长因子的UPLC-Q-TOF-MS测定方法和量化确证策略*

2022-10-23欧阳淑娟伍英英方继辉

广州化工 2022年18期

吴震，欧阳淑娟，伍英英，方继辉

(国家药监局化妆品风险评估重点实验室,广东省药品检验所，广东广州 510663)

为有效识别和防控化妆品中非法使用人表皮生长因子(EGF)的风险，前文《酶联免疫法快速筛查化妆品中非法使用人表皮生长因子》和《高效液相色谱法测定化妆品中非法使用人表皮生长因子》介绍了先采用酶联免疫(ELISA)法快速筛查出疑似样品，再用高效液相色谱(HPLC)方法定量和确证的策略[1-2]。利用超高效液相色谱四极杆飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF-MS)方法高效、精确的特点，以及与ELISA方法原理互补，在HPLC方法上又有扩展提高的优势，本工作建立了化妆品经提取过滤，用UPLC分离，使用ESI正离子多反应模式检测，外标法定量的测定方法。

随着分析技术的发展，目标可能被多个不同方法分析，受不同误差影响，其结果未必一致；从实际合理性出发，对目标的分析也不可能是无休止和绝对的，这导致实际分析中需要可操作性的确证策略[3]。欧洲食用动物兽药残留监管机构曾提出了一个基于质谱技术识别分值的定性确证策略[4-5]，为食品领域兽药残留的确证提供了非强制性解决方案。在此基础上，本工作根据化妆品中生物制品分析的需求和实际情况，提出了一种化妆品中EGF检测的综合量化确证策略：联用原理上互不干扰的数种检测方法，在符合一定要求的前提下，根据目标和检测特征分别赋予分值，依据总分值对结果进行不同程度的肯定。

类似的方法和确证策略国内尚未见报道，也没有相关标准和法定方法出台。化妆品中EGF的快速筛查、测定和确证策略体系的建立，将为识别、评估和防控化妆品中非法使用EGF的安全风险提供有力的科学监管工具和技术支持。量化确证策略的提出，为化妆品中物质的确证提供了一个参考解决方案。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

BSA，生物试剂，使用前先确认对EGF检测无干扰；氯化钠(分析纯)，广试；乙腈、甲酸，质谱纯，CNW；一级实验用水；0.4%(w/w)的BSA氯化钠溶液：取0.4 g的BSA加氯化钠30 g加水100 mL溶解经滤膜过滤；对照品：重组人表皮生长因子GMP-105-04(批号EGMP10504062，含量98.82%)，上海普欣；阳性对照样品：外用重组人表皮生长因子(批号20180826-2)，上海昊海生物；重组人表皮因子滴眼液(批号201908089C)，桂林华诺威基因。

UPLC-Q-TOF-MS仪(1290+6450+ESI)，美国Agilent公司；XS205DU分析天平，瑞士METTLER公司；5810R高速冷冻离心机，美国Eppendorf公司；滤膜:0.22 μm 聚四氟乙烯(PTFE)，津腾公司；Milli-Q超纯水系统，美国Millipore公司；涡旋混合器，德国IKA 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 色谱条件

色谱柱：ACULTY UPLC BEH C18(1.7 μm，2.1 mm×100 mm)；柱温：25 ℃；样品盘：4 ℃避光；进样量：20 μL；流动相流速：0.25 mL/min；流动相：A为0.1%(w/w)甲酸溶液，B为0.1%(w/w)甲酸乙腈溶液；梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution procedure

1.2.2 质谱条件

离子源：ESI；采集：分段采集；干燥气温度：350 ℃；干燥气流量：8 L/min；雾化气压力：40 psig；毛细管电压：4000 V；Fragmentor电压：175 V；Skimmer电压：65 V；八极杆射频电压：750 V；正离子多反应监测模式；碰撞能：3.7*(离子质荷比)/100+2.5；选择离子质荷比1036.9584；电荷数6。EGF的特征离子参数见表2。特征母离子同位素相对丰度及子离子相对丰度的最大允许偏差见表3。

表2 EGF特征离子参数Table 2 Mass spectrometric parameters of EGF

表3 离子相对丰度的最大允许偏差Table 3 Maximum permission deviation of ion relative abundance

1.3 样品处理

冻干粉：称取均匀的冻干粉样品20 mg，加入1 mL的0.2%(w/w) BSA溶液溶解，用0.22 μm的PTFE滤膜过滤，得试样溶液，必要时稀释。水剂：称取水剂样品0.5 g，加入0.4%(w/w) BSA氯化钠溶液至1 mL，振摇混匀，用0.22 μm的PTFE滤膜过滤，得试样溶液，必要时稀释。啫喱：称取啫喱样品0.5 g，加入0.4%(w/w) BSA氯化钠溶液至1 mL，振摇混匀，必要时以4000 r/min离心15 min，取水层用0.22 μm的PTFE滤膜过滤，得试样溶液，必要时稀释。

1.4 系列加标标准溶液配制

将对照品用水溶解配制成1 g/L质量浓度的对照品储备溶液。选取5份与待测化妆品性质尽可能相似的均匀不含EGF的化妆品作为空白基质，分别加入适量对照品储备溶液，按样品处理方法进行处理，得到为EGF质量浓度为0.5 μg /mL、1 μg /mL、2 μg /mL、5 μg /mL、10 μg /mL且BSA浓度恒定为0.2%(w/w)的系列浓度加标标准溶液。加标标准溶液现用现配，4 ℃避光保存。

1.5 方法学考察

1.5.1 空白实验

分别取0.2%(w/w) BSA溶液、0.4%(w/w) BSA氯化钠溶液和不同化妆品剂型的空白基质试样溶液按条件进行检测，检查干扰情况。

1.5.2 检出限和定量下限

将不同浓度含EGF的加标标准溶液按条件进行检测，检查特征峰面积信噪比应分别大于3和10。

1.5.3 线性范围

将系列加标标准溶液进行检测，以质量浓度为横坐标，以特征离子峰面积为纵坐标进行线性拟合。

1.5.4 重复性

选取定量下限浓度，2倍定量下限浓度和加标标准溶液最高浓度，不同剂型化妆品加标标准溶液一日内重复检测6次，考察特征峰面积变化。

1.5.5 回收率

选取定量下限浓度，2倍定量下限浓度和加标标准溶液最高浓度，不同剂型化妆品中加入EGF对照品的重复实验6次，考察相对加标标准溶液的回收百分率。

2 结果与讨论

2.1 色谱和质谱条件优化

EGF在UPLC-Q-TOF-MS仪器中经ESI源后的离子以多种电荷存在。通过特征离子丰度对比，发现当电荷数z=6时，特征母离子的丰度最高。通过回溯EGF的结构，理论计算得到的精确质荷比(m/z=1036.9584)与实际仪器经校准后检测得到的结果相对误差小于百万分之五，证实了对照品和检测方法是有效的。

EGF在溶液环境中不太稳定，且在UPLC-Q-TOF-MS仪器中吸附现象非常严重，极大地干扰结果。经对比研究后，选择使用固定高浓度的BSA溶液作为提取剂可以较好地使EGF保持稳定且可得到可信的检测结果。这可能因为EGF与BSA结构相似，存在竞争吸附现象。高浓度的BSA可以相对极大抑制EGF的吸附，同时如果BSA在实验过程中保持浓度相对一致，可以使EGF的吸附处于相对稳定水平，从而不影响实验结果。

三家不同实验室分别使用了美国Agilent公司1260、1290液相色谱仪，美国Aglient公司6450和美国Thermo公司 QE 四极杆飞行时间质谱仪，ACULTY UPLC BEH C18(1.7 μm， 2.1 mm×100 mm)、Thermo Hypersil GOLD(1.9 μm，2.1 mm×50 mm)， X-Bridge C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)色谱柱按本方法进行了测试和验证，过程中进行了400余次检测，结果证明本方法耐用性良好。

2.2 方法学考察结果

2.2.1 空白实验

不同剂型化妆品空白基质中EGF的提取色谱图均无干扰。加标标准溶液的特征母离子质谱图、选择特征母离子色谱图和选择特征子离子质谱图分别如图1、图2和图3所示。

图1 EGF母离子质谱Fig.1 Mass spectrum of EGF parent ion

图2 EGF选择离子色谱Fig.2 Chromatography of EGF selected ion

图3 EGF选择子离子质谱Fig.3 Mass spectrum of EGF selected daughter ion

2.2.2 检出限和定量下限

本实验室得到检出限为0.2 μg/mL，按冻干粉取样量 20 mg计，检出质量浓度为10 μg/g，定量下限质量浓度为25 μg/g；如以水剂或啫喱取样量0.5 g计，检出质量浓度为0.4 μg/g，定量质量下限为1 μg/g。

2.2.3 线性和线性范围

本实验室在0.5～10 μg/mL内EGF浓度与特征峰面积线性关系良好，R2大于0.9967，如表4所示。结果的线性关系比HPLC-DAD结果的线性稍差，这是受Q-TOF-MS的原理制约和基质效应影响导致的。

表4 线性回归方程及相关系数Table 4 Linear regression equations and sqaredcorrelation coefficients

2.2.4 重复性

本实验室在线性范围内3个不同浓度条件下重复性基本良好，冻干粉的低、中浓度，啫喱的中、高浓度的重复性受基质效应一定影响，如表5所示。结果的重复性比HPLC-DAD结果的重复性稍差表明质谱方法更容易受到基质效应的影响。通过对重复性、线性和稳定性等数据的分析，为减小基质效应对结果的影响，研究最后选择使用了空白基质加标标准溶液。

表5 精密度结果Table 5 Results of test for precision

2.2.5 回收率

本实验室在线性范围内3个不同浓度条件下回收率良好，回收率96.6%～116.6%，RSD小于5.0%，如表6所示。

表6 回收率结果Table 6 Results of test for recovery

2.3 确证策略

在检测结果的确证中，一般情况下会遇到多个方法相互间的关系，希望能用不同的方法互相印证，得到确定的结果。但多个检测方法的结果未必一致，无论是粗暴地用“第一法”作为确证方法，还是简单地用一个方法否定另一个方法都是不科学的。此时需要根据检测方法的特征原理分析，制定一个科学、可操作性的确证策略。

本研究提出了一个量化的确证策略：对于不同检测方法，将原理上互不干扰的检测特征赋予不同分值(重复的特征不重复计分)，在符合一定质量要求前提下，用总分值对结果进行不同程度的肯定判断。量化确证策略允许根据实际条件对检测方法灵活选择和不同组合，也允许根据检测技术的发展，在更多、更新方法出现时进行扩展。

化妆品EGF的众多检测方法中，ELISA过程虽然涉及到抗原抗体反应、催化分解、显色反应等多个步骤，但是最后具有可控质量特征的仅为吸光度测量，所以赋1分。参考文献2中使用到的免疫斑点法和免疫荧光法由于使用了同样的抗原抗体反应原理，故同样只赋1分，且相同原理不能重复计分(除非位点有适当的差异)。HPLC和UPLC的保留时间是同一原理的特征，保留时间是被测物质在色谱柱中分配特性的可控质量的特征，赋1分。由于DAD光谱可以是具有多个特征的连续的反映被测物质光谱吸收的可控质量的特征，相对于单波长紫外检测可显示更多特征，可以赋2分。质谱的母离子质量数是可以反映被测物质的质量的可控质量的特征，相对与一般质谱，高精度质谱特征可以赋2分。如果被测物质因同位素分布等原因存在多个特征母离子，为避免重复特征计分，需同时检查同位素丰度特征，此时最多可以按两个特征母离子特征计分；同理，为避免重复特征计分，对于高精度质谱特征母离子的子离子可以赋3分，在检查相对丰度特征情况下最多可以按两个子离子特征计分。根据实际检测结果的不同特征计算总分。考虑到EGF作为多肽类，具有结构复杂，分子量大，重组生产过程复杂，不稳定等特点，在确证策略中要求总分获得1分及以上为筛查结果；获得4分及以上为测定结果；获得三种原理上互不干扰的检测特征且总分6分及以上为确证结果。化妆品中EGF的确证策略如图4所示，其中结果特征需符合表7的质量要求。

图4 化妆品中EGF检测的量化确证策略Fig.4 Quantified determination strategy for EGF analysis in cosmetics

表7 检测特征质量要求Table 7 Quality requirements of analysis characteristics

2.4 样品的测定和确证

按照实验方法对源于网络购买、国家化妆品监督抽检、广东省化妆品风险监测的共36个品种化妆品进行测定(其中冻干粉剂13个，水剂15个，啫喱剂8个)，并根据量化确证策略，对使用ELISA筛查方法、HPLC-DAD测定方法和UPLC-Q-TOF-MS测定方法检测的结果进行确证，发现1批次标称冻干粉化妆品原料和1批次标称冻干粉化妆品中含有EGF，含量分别为26670 μg/g和46.5 μg/g。