lncRNA SNHG7对胶质瘤细胞侵袭、迁移的影响

王昆鹏 张建党 董孟宁 刘素杰 徐广建

胶质瘤是最常见的恶性脑肿瘤[1]。近年来，胶质瘤的研究已经取得了很大进展，但是总体生存率仍未见明显提高[2]。探索胶质瘤发病机制，对于改善胶质瘤的治疗效果具有重要意义。长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）在表观遗传调控、细胞分化及细胞周期调控等过程中发挥重要作用，与肿瘤发生发展密切相关[3～6]。研究发现，lncRNA小核仁RNA 宿主基因7（small nucleolar RNA host gene 7，SNHG7）与前列腺癌[7]、胰腺癌[8]等增殖和侵袭有关。本文分析lncRNA SNHG7与胶质瘤病人预后的关系及其对瘤细胞细胞侵袭和迁移的影响。

1 材料与方法

1.1 组织样本来源 纳入标准：病理检查证实为胶质瘤；术前未接受放疗、化疗或免疫治疗；临床资料完整。排除标准：合并其他肿瘤；合并严重心、肝、肾等脏器功能疾病；合并免疫或代谢性疾病。选取2015年6 月至2016 年3 月符合上述标准的胶质瘤80 例，其中男48 例，女32 例；年龄28～72 岁，平均（47.01±9.23）岁；WHO分级为Ⅰ级10例，Ⅱ级22例，Ⅲ级22例，Ⅳ级26 例；术后随访截止2020 年4 月。另选取颅脑损伤颅内减压术中切取的非肿瘤脑组织50 例为对照，其中男26 例，女24 例；年龄23～68 岁，平均（46.80±6.27）岁。本研究获医院伦理委员会批准。

1.2 RT-PCR 检测组织lncRNA SNHG7 水平TRIzol试剂（上海源叶生物科技有限公司）提取组织总RNA。用反转录试剂盒（上海一研生物科技有限公司）获得cDNA，随后用2×SYBR Green PCR Mastermix 试剂盒（上海一研生物科技有限公司），以cDNA为模板进行PCR 反应，反应条件：95 ℃、10 min；95 ℃、30 s；60 ℃、15 s；72 ℃、20 s；40 个循环；72 ℃、10 min。用2-△△Ct法计算相对表达量。以表达量中位数为截断值，分为高表达组和低表达组。

1.3 细胞培养及siRNA 转染 胶质瘤细胞株U87（中科院上海细胞库）在含10%胎牛血清（上海唯科生物制药有限公司）的DMEM F12培养基（上海唯科生物制药有限公司）中进行培养。待细胞密度达到60%时，用Lipofectamine 2000试剂盒（上海吉凯基因科技有限公司）进行转染，分别用sh-RNA（序列5'-CAAGGUCAUCCAUUCA-3'）或阴性对照转染U87细胞，设置为sh-SNHG7 组、sh-CON 组。质粒均由爱康得生物科技（苏州）有限公司提供。转染后用RTPCR检测细胞lncRNA SNHG7相对表达量。

1.4 细胞侵袭和迁移检测 用Transwell 实验检测胶质瘤U87 细胞的侵袭和迁移。迁移实验：在Transwell 小室（上海唯科生物制药有限公司）上室加入5×104个U87 细胞，下室中加入600 μl 完全培养基，培养24 h；固定膜底细胞，随后用0.1%结晶紫染色；显微镜下对细胞数量进行定量。侵袭实验：使用预先加入Matrigel 胶（上海唯科生物制药有限公司）的小室，上室加入5×104个U87细胞，培养48 h，随后步骤同迁移实验。

1.5 lncRNASNHG7对miR-4516的靶向调控作用 用TargetScan 发现lncRNA SNHG7 与miR-4516 有互补结合位点。随后用双荧光素酶报告基因实验验证二者的靶向调节关系。试剂盒购于深圳市默赛尔生物医学科技发展有限公司。将lncRNA SNHG7突变型荧光酶报告载体（PGLO-SNHG7-MUT）、野生型荧光素酶报告载体（PGLO-SNHG7-WT）分别同miR-4516 模拟物（miR-4516 mimics）、模拟阴性对照（miR-NC）或抗miR-4516（anti-miR-4516）共转染细胞，随后检测荧光素酶活性。为进一步验证lncRNA SNHG7对miR-4516的靶向调控作用，用质粒或过表达载体（爱康得生物科技（苏州）有限公司提供）转染U87细胞，将细胞分为miR-NC 组、miR-4516 mimics组、anti-miR-4516 组，检测lncRNA SNHG7 相对表达水平；pcDNA3.1 组、pcDNA3.1-SNHG7 组、sh-NC组、sh-SNHG7组，检测miR-4516相对表达水平。

1.6 lncRNA SNHG7调控miR-4516对胶质瘤细胞侵袭和迁移的影响 分别用sh-SNHG7质粒、anti-miR-4516、阴性对照质粒转染U87 细胞，将细胞分为sh-NC+miR-NC组、sh-SNHG7+miR-NC组、sh-SNHG7+anti-miR-4516组，检测各组细胞侵袭和迁移。

1.7 统计学方法 采用SPSS 22.0软件分析；计量资料用±s表示，用t检验和单因素方差分析、LSD-t 检验；用多因素Cox 比例回归风险模型分析生存预后影响因素；Kaplan-Meier曲线分析lncRNA SNHG7表达水平与与生存预后的关系；P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胶质瘤组织lncRNA SNHG7 表达水平及其与病人生存预后的关系 胶质瘤组织lncRNA SNHG7 相对表达量明显高于对照组（P＜0.05，图1A）。多因素Cox 回归分析显示，lncRNA SNHG7高表达是胶质瘤病人不良生存预后的独立影响因素（P＜0.05，表1）。生存曲线分析显示，高表达组胶质瘤病人中位总生存期较低表达组明显缩短（P＜0.05；图1B）。

表1 本文80例胶质瘤生存预后影响因素的Cox回归分析

图1 胶质瘤组织lncRNA SNHG7 表达水平变化及其与病人生存预后的关系A. 胶质瘤组织lncRNA SNHG7 表达变化，与对照组相比，* P＜0.05；B.生存曲线分析lncRNA SNHG7 表达水平与胶质瘤病人生存预后的关系

2.2 下调lncRNA SNHG7 对胶质瘤U87 细胞侵袭和迁移的影响 与sh-CON 组比较，sh-SNHG7 组lncRNA SNHG7 相对表达量、侵袭能力和迁移能力均明显降低（P＜0.05；图2）。

图2 敲低lncRNa SNHG7表达对胶质瘤U87细胞侵袭和迁移的影响

2.3 lncRNA SNHG7 对miR-4516 的靶向调控作用TargetScan 预测lncrNA SNHG7 和miRNA-4516 有结合位点（图3A）。胶质瘤U87 细胞转染miR-4516 mimics 后PGLO-SNHG7-WT 的荧光素酶活性明显受到抑制，而anti-miR-4516 可以增强PGLO-SNHG7-WT 的荧光素酶活性（P＜0.05，图3B）。转染miR-4516 mimics 后，胶质瘤U87 细胞lnc RNA SNHG7 表达水平明显下降，而转染anti-miR-124 可使胶质瘤U87细胞LNCRNA SNHG7表达水平升高（P＜0.05，图3C）。胶质瘤U87 细胞转染pcDNA3.1-SNHG7 后，miR-4516 表达水平明显降低（P＜0.05，图3D）。以上结果表明lncRNA SNHG7 靶向调控miR-4516。

图3 双荧光素酶报告基因实验验证lncRNA SNHG7 靶向调控miR-4516

2.4 lncRNA SNHG7 调控miR-4516 对胶质瘤U87 细胞侵袭和迁移的影响 与sh-NC+miR-NC 组比较，sh-SNHG7+miR-NC 组U87 细胞侵袭和迁移能力均明显下降（P＜0.05）。与sh-SNHG7+miR-NC 组比较，sh-SNHG7+anti-miR-4516组侵袭和迁移能力均明显提高（P＜0.05）。见图4。

图4 lncRNA SNHG7 靶向调控miR-4516 表达对胶质瘤U87细胞侵袭和迁移的影响

3 讨论

胶质瘤是颅内最常见的原发性恶性肿瘤，由于胶质瘤的侵袭性，手术很难完全切除，术后易复发，而且胶质瘤通常发生放化疗抵抗现象，因此，胶质瘤预后不理想。需要进一步研究胶质瘤进展的机制来确定和发展新的治疗策略。近年来，寻找胶质瘤生物学标志物是研究热点，其中lncRNA在胶质瘤中的作用逐渐受到重视[9]。lncRNA SNHG7 位于染色体9q34.3，全长984 bp。研究发现lncRNA SNHG7具有癌基因的作用，其失调与多种肿瘤的发生和进展有关[7，8]。本研究发现，lncRNA SNHG7 在胶质瘤中表达上调，lncRNA SNHG7 高表达是胶质瘤不良生存预后的独立影响因素，沉默lncRNA SNHG7 表达后，胶质瘤U87 细胞的侵袭及迁移能力明显下降。这提示lncRNA SNHG7在胶质瘤中可能起到癌基因的作用，促进肿瘤进展。

lncRNA SNHG7 是最近发现的一种lncRNA，其表达上调促进肿瘤的增殖和存活。研究发现，lncRNA SNHG7 在乳腺癌组织中显著上调，应用siRNA 敲低lncRNA SNHG7 的表达显着抑制乳腺癌细胞的增殖和侵袭，其机制与靶向调控miRNA-381有关[10]。She等[11]发现肺癌组织lncRNA SNHG7表达明显升高，通过增强FAIM2 表达促进肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。近年来，越来越多的研究发现，lncRNA SNHG7可以提供靶向不同miRNA促进胶质瘤细胞增殖、侵袭、迁移[12～16]。

我们应用TargetScan 预测显示lncRNA SNHG7和miRNA-4516 有结合位点；用双荧光素酶报告实验证实miRNA-4516是lncRNA SNHG7的靶基因；转染miR-4516 mimics 后，胶质瘤U87 细胞SNHG7 表达水平明显下降，而转染anti-miR-124 可使胶质瘤U87 细胞lncRNA SNHG7 表达水平明显升高；转染pcDNA3.1-SNHG7，胶质瘤U87 细胞miR-4516 表达水平明显降低。这证实lncRNA SNHG7可以靶向调控miR-4516。研究发现，miR-4516 在胶质母细胞瘤[17]、肝细胞癌[18]等中发挥癌基因作用，促进肿瘤细胞增殖、侵袭及迁移。本研究发现，转染sh-SNHG7质粒后胶质瘤细胞的侵袭及迁移能力明显下降，而共转染sh-SNHG7 和anti-miR-4516 后侵袭和迁移力又明显升高，说明lncRNA SNHG7 可以通过靶向调控miR-4516促进胶质瘤细胞的侵袭和迁移。

总之，胶质瘤组织lncRNA SNHG7呈高表达，与病人不良生存预后有关。lncRNA SNHG7 通过靶向调控上调miR-4516 表达促进胶质瘤细胞的侵袭和迁移。