脑胶质瘤病人血浆miR-9-3p的变化及其与病人临床预后的关系

孙玉书 王 飞 王振飞 王选平 牟永平

胶质瘤是成人颅内最常见的恶性肿瘤[1]。近年来，胶质瘤的治疗主要依靠手术切除，并结合放疗和化疗的联合治疗，但脑胶质瘤具有高度侵袭性，术后容易复发，中位生存期仅12个月[2]。因此，探讨脑胶质瘤的发病机制，寻找新的诊断和治疗方法显得尤为重要。微小核糖核酸（microRNA，miRNA）是一类长度22～24 个核苷的非编码RNA，在进化上高度保守，通过与靶基因mRNA 3'-UTR区域结合调控基因的表达，调节细胞分化、凋亡、细胞周期、增殖和分裂等[3，4]。Yang 等[5]研究发现，脑胶质瘤组织miRNA 芯片差异表达谱中miR-9-3p 表达下调。本文选取42例脑胶质瘤和20 例健康体检者为对照，用RT-PCR法检测血浆miR-9-3p 水平，分析血浆miR-9-3p 水平与脑胶质瘤病人生存预后的关系。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取2016 年3 月1 日至2019 年3 月1日收治的脑胶质瘤42 例，其中男23 例，女19 例；年龄14～68 岁。另选20 例同期健康查体者为对照，其中男11例，女9例；年龄18～65岁。本研究经内蒙古医科大学伦理委员会批准，病人签署知情同意书。

1.2 术后随访 采用电话、微信、门诊等方式随访，随访时间为手术之日到死亡或末次随访时间至2021年3月1日。本文42例脑胶质瘤随访24～60个月，记录生存情况。

1.3 PCR 检测血浆miR-9-3p 水平 术前取静脉血2 ml，离心分离血浆备用。使用miRcute miRNA 血清/血浆提取分离试剂盒（北京天根生化公司）提取血浆总RNA，测定总RNA 浓度和纯度，置-80 ℃保存备用。使用增强型miRNA cDNA 第一链合成试剂盒（北京天根生化公司）反转录为cDNA，应用miRcute（SYBR Green）增强型miRNA 荧光定量检测试剂盒（北京天根生化公司）扩增，使用ABI 公司7500 系列实时荧光定量PCR 仪进行扩增。扩增条件：95 ℃、15 min 起始模板变性，然后94 ℃、20 s，64 ℃、30 s，5个循环，富集低丰度目标miRNA，94 ℃、20 s，PCR循环中模板变性；72 ℃、34 s 退火、延伸；60 ℃、34 s 收集荧光，40 个循环。检测重复3 次，取平均值。以U6为内参，应用2-ΔCT法量化分析。以血浆miR-9-3p平均值为准，分为低表达和高表达。miR-9-3p 引物正义链5'-TCT TTG GTT ATC TAG CTG TAT GA-3'，反义链5'-ATA CAG CTA GAT AAC CAA AGA TT-3'。

1.4 统计学方法 采用SPSS 25.0软件分析；定量资料以±s表示，采用t检验；计数资料采用χ2检验；多因素Cox 比例回归风险模型分析生存预后影响因素；Kaplan-Meier 生存曲线分析miR-9-3p 水平与脑胶质瘤生存预后的关系；检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 脑胶质瘤病人血浆miR-9-3p的变化 与对照组相比，脑胶质瘤病人血浆miR-9-3p 水平明显下降（P＜0.05，图1）。

图1 脑胶质瘤病人血浆miR-9-3p水平明显降低

2.2 血浆miR-9-3p 水平与脑胶质瘤病人临床特征的关系 脑胶质瘤病人血浆miR-9-3p 与病人年龄、性别、肿瘤位置无明显相关性（P＞0.05），而与脑胶质瘤病理分级相关（P＜0.05）。见表1。

表1 血浆miR-9-3p水平与脑胶质瘤病人临床特征的关系

2.3 脑胶质瘤病人预后影响因素 多因素Cox回归分析显示，肿瘤病理分级Ⅰ～Ⅱ级（OR=0.026；95% CI 0.002～0.366；P=0.007）、血浆miR-9-3p 高表达（OR=0.047；95% CI 0.004～0.502；P=0.011）的脑胶质瘤病人生存预后较好。

2.4 血浆miR-9-3p 水平与脑胶质瘤病人生存期的关系 生存曲线分析显示，血浆miR-9-3p 低表达脑胶质瘤病人中位总生存期较高表达脑胶质瘤病人明显缩短（P＜0.05，图2）。

图2 生存曲线分析血浆miR-9-3p水平与脑胶质瘤病人生存期的关系

3 讨论

miRNA 既可作为抑癌基因下调癌基因活性，也可作为癌基因下调抑癌基因活性，参与人类肿瘤的形成[6]。miR-9-3p定位于15号染色体q26.1，在多种肿瘤中异常表达。研究表明，甲状腺髓样癌miR-9-3p 表达上调，靶向调控BLCAP 抑制细胞凋亡，促进肿瘤生长[7]。但也有研究表明miR-9-3p具有抑制肿瘤生长的作用，例如乳腺癌miR-9-3p 靶向调节ITGB1的表达，抑制乳腺癌生长[8]，肝癌细胞miR-9-3p靶向调控TAZ 发挥抑癌基因的作用[9]。本文结果显示脑胶质瘤病人血浆miR-9-3p显著下调，与胶质瘤病理分级密切相关，是病人生存预后不良的独立危险因素。杜鹏等[10]研究发现miR-9 通过促进LDHA表达，增强肿瘤细胞有氧糖酵解，促进人脑胶质瘤LN229 细胞增殖。这提示miR-9-3p 在人脑胶质瘤中具有抑癌基因的功能。

总之，人脑胶质瘤miR-9-3p 表达下调，与病人不良生存预后密切相关。