广西毛冬青根对放射脑损伤小鼠认知功能障碍的改善作用及其机制研究*

张馨月，李 婷，何改改，滕雨梦，黎 莹，王绍军，韦 力△

（1.广西医科大学基础医学院，南宁 530021；2.广西医科大学第一临床医学院，南宁 530021；3.广西壮族自治区妇幼保健院，南宁 530005）

头颈部肿瘤作为危害人类健康的主要疾病之一，其发病率位于全球恶性肿瘤的前列，占所有癌症总人数的5.3%[1]。目前，临床上常采用放射治疗作为头颈部肿瘤主要的治疗方法，在提高患者生存率的同时，也带来了许多并发症，如头痛、恶心、口干、记忆功能减退等，其中，认知障碍是头颈部肿瘤放疗后严重并发症，很大程度上影响患者的生活质量，但目前其具体发病机制尚未明确[2]。胶质纤维酸性蛋白（GFAP）是星形胶质细胞特异性标志蛋白，抗离子钙结合衔接分子1（Iba-1）是小胶质细胞特异性标志物，在脑损伤状态下，星型胶质细胞和小胶质细胞被激活，星型胶质细胞GFAP 表达和小胶质细胞Iba-1表达增强[3-5]。本课题组前期研究表明，放射可以促进小鼠海马区星型胶质细胞和小胶质细胞活化，同时发现放射诱导活化的胶质细胞在认知功能障碍发生、发展和转归中起重要作用[6]，虽然其机制尚未清楚，但也为防治放射脑损伤提供新的途径。

广西毛冬青（Ilex pubescens Hook.et Arn.var.kwangsiensis Hand-Mazz）为本属植物毛冬青变种，主产于广西百色和凌云，具有舒张血管、清热解毒、抗血栓及抗炎等作用[7-8]。有研究表明，毛冬青能够减轻炎症反应，缓解神经细胞水肿，对脑缺血梗死损伤起到保护作用[9-10]。然而，毛冬青是否能够通过调节胶质细胞活性及状态，改善放射诱导的认知功能障碍，目前鲜少报道。本研究通过建立放射性脑损伤小鼠模型，探讨广西毛冬青根对放射性脑损伤学习记忆的影响及其机制，为临床防治放射带来的认知功能损伤提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF 级雄性昆明小鼠100 只，5 周龄，体重（25±3）g，购于广西医科大学实验动物中心，动物生产许可证号为SCXK（桂）2014-0002。所有小鼠饲养于广西医科大学动物房，予以标准饲料喂养，温度为（25±2）℃，12 h 明暗交替，自由饮水和摄食，适应性饲养1 周后进行实验。本实验按照《国家卫生研究院实验动物关爱与使用指南》进行。

1.2 主要试剂与仪器

毛冬青汤剂由广西壮族自治区妇幼保健院提供；酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒、苏木精—伊红（HE）染色试剂盒购于北京索莱宝科技有限公司；Iba-1 抗体、GFAP 抗体均购于Abcam 公司。Morris水迷宫购于中国科学研究院；60Co 治疗仪由广西医科大学第一附属医院提供。

1.3 实验方法

1.3.1 动物模型与分组 将100只雄性昆明小鼠随机分为4组：对照组、毛冬青组、放射组和放射+毛冬青组，每组25 只。毛冬青组和放射+毛冬青组小鼠于放射前给予毛冬青溶液连续灌胃7 d（1 mL/30 mg），其余各组在同等条件下给予等量生理盐水。采用0.3%戊巴比妥钠溶液进行腹腔注射麻醉，并将小鼠固定于自制模具中，放置于照射台上，照射范围为双眼后眦连线和双耳后连线之间。采用60Co γ射线进行照射，放射组和放射+毛冬青组照射剂量10 Gy/次，隔天照射，总剂量为20 Gy。对照组和毛冬青组实验条件一致，照射剂量为0 Gy。

1.3.2 Morris 水迷宫实验 造模成功后，每组随机选取5 只小鼠进行水迷宫实验，将一圆柱形平台放置于第Ⅱ象限的中央处，倒入墨水，水温维持在24～26 ℃，周围环境保持相对稳定。放射前8 d 开始进行实验，前3 d 平台高出水面1 cm，后5 d 平台沉于水面下1 cm，记录每只小鼠找到平台的时间，即为小鼠的逃避潜伏期（EL）。放射后撤去平台，记录小鼠的平均速度、第1次穿越平台的时间、穿越平台的次数、中环停留时间、外环停留时间以及中心区域的停留时间。

1.3.3 旷场试验 各组随机选取5只小鼠于放射前3 d 和放射后，放进100 cm×100 cm×100 cm 的无盖黑色方箱中，通过动物运动轨迹记录系统观察记录小鼠5 min 内的平均速度、目标区域的运动距离以及第1次进入目标区域的时间。

1.3.4 避暗实验 避暗箱分为前半部明室和后半部暗室两部分，两室之间以直径为3 cm 的空洞相通。避暗箱底部为铜栅，后半部暗室通以36 V的电压，实验开始时将小鼠背对入口放入明室内，记录小鼠从放入明室到钻进暗室触电的时间，即为EL，同时记录小鼠在3 min 内进入暗室的次数，即为错误次数。

1.3.5 ELISA实验测定血清白细胞介素-6（IL-6）的水平 行为学实验结束后，采用0.3%戊巴比妥钠溶液对小鼠进行腹腔注射，眼球取血，4 ℃离心，取上清。将ELISA试剂盒室温复温30 min后，根据说明书流程进行操作，酶标仪检测各组的吸光度（A）值，并计算出各组血清中IL-6的浓度。

1.3.6 HE 染色观察脑组织病理变化 麻醉后取脑，将脑组织固定于4%多聚甲醛固定液中，24 h 后脱水包埋，将组织切成厚度为4 μm 的切片，按照试剂盒说明书行HE染色，观察脑组织病理改变。

1.3.7 免疫荧光实验检测小鼠脑组织Iba-1 和GFAP 表达水平 石蜡切片经过脱蜡和抗原修复后，分别加入一抗：抗Iba-1（1∶1 500）和抗GFAP（1∶800）抗体4 ℃孵育过夜，经二抗孵育、DAPI 染色后封片，于荧光显微镜下观察。每张切片随机选取3个视野，并用Image J软件进行图像分析。

1.4 统计学方法

采用SPSS 26.0统计软件和GraphPad Prism 8.0软件进行数据分析和制图，计量资料以均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），组间两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 毛冬青对放射后小鼠Morris 水迷宫实验结果的影响

放射前，各组小鼠EL未见明显差异（P＞0.05）；放射后，与对照组比较，放射组平均速度、穿越平台次数减少，中环停留时间和中心区停留时间均缩短（均P＜0.05）；第1次穿越平台所用时间和外环的停留时间延长（均P＜0.05）；与放射组比较，放射+毛冬青组平均速度、穿越平台次数增加，中环停留时间和中心区停留时间增加，第1 次穿越平台所用时间和外环的停留时间缩短（均P＜0.05），见图1。

图1 各组小鼠Morris水迷宫实验结果比较

2.2 毛冬青对放射后小鼠旷场实验结果的影响

与对照组比较，放射组小鼠平均速度降低，目标区域的运动距离缩短（均P＜0.05）；第1次进入目标区域的时间延长（P＜0.05）；与放射组比较，放射+毛冬青组小鼠平均速度及在目标区域的运动距离均增加，第1 次进入目标区域的时间缩短（均P＜0.05），见图2。

图2 各组小鼠旷场试验结果比较

2.3 毛冬青对放射后小鼠避暗实验的影响

与对照组比较，放射组小鼠EL缩短，错误次数增加（均P＜0.05）；与放射组比较，放射+毛冬青组小鼠EL 较放射组延长，错误次数也减少（均P＜0.05），见图3。

图3 各组小鼠避暗实验比较

2.4 各组小鼠血清IL-6水平比较

与对照组比较，放射组小鼠血清IL-6水平增高（P＜0.05），与放射组相比较，放射+毛冬青组小鼠血清IL-6水平降低（P＜0.05），见图4。

图4 各组小鼠血清IL-6水平比较

2.5 各组小鼠脑组织海马区组织病理学改变

对照组和毛冬青组海马区细胞组织结构清晰完整，染色均匀，细胞排列整齐、紧密，细胞周围间隙较为致密，无明显水肿；放射组细胞排列分散，间质水肿，胞体缩小、胞质浓缩，出现核固缩现象，经毛冬青干预后，放射+毛冬青组小鼠海马区组织结构明显改善，见图5。

图5 各组小鼠脑组织海马区细胞组织病理学变化（HE染色，×400）

2.6 各组小鼠脑组织小胶质细胞Iba-1表达水平比较

与对照组比较，放射组小鼠脑组织中Iba-1表达水平显著增高（P＜0.05），小胶质细胞呈圆形或椭圆形，排列紧密，细胞体积增大，细胞突起增粗、增长，呈激活状态；与放射组比较，放射+毛冬青组小鼠脑组织小胶质细胞体积变小，突起变细、变短，排列较为稀疏，Iba-1表达水平降低（P＜0.05），见图6。

图6 各组小鼠脑组织中小胶质细胞Iba-1表达水平比较（免疫荧光染色，×200）

2.7 各组小鼠脑组织星形胶质细胞GFAP 表达水平比较

对照组和毛冬青组GFAP 阳性表达较少，胞体小，分布稀疏，突起较细。放射组星形胶质细胞GFAP 表达水平升高（P＜0.05），细胞排列密集、胞体增大，突起变粗；与放射组比较，放射+毛冬青组小鼠脑GFAP表达水平降低（P＜0.05），细胞排列较稀疏、胞体变小，突起较细，见图7。

图7 各组小鼠脑组织中星形胶质细胞GFAP表达水平比较（免疫荧光染色，×200）

3 讨论

放射性脑损伤是放射治疗头颈部肿瘤后最为严重的并发症，以神经系统的功能损害为主，可出现海马相关的学习和记忆功能障碍[11]。本研究通过Morris水迷宫实验发现，放射后，小鼠在水迷宫中游泳的平均速度、穿越平台次数、中环停留时间及外环停留时间减少，第1 次穿越平台和外环停留时间明显增加，与文献[12-13]报道一致。而经毛冬青干预后，小鼠记忆功能明显好转，这提示毛冬青对于放射性脑损伤小鼠的认知功能具有保护作用。

旷场实验主要用于检测小鼠自发性活动和探索行为，是评价实验动物在新环境中自主行为、探索行为和紧张度的方法[14]。小鼠旷场行为实验结果显示，放射组小鼠平均速度降低，目标区域的运动距离缩短，第1 次进入目标区域的时间有所延长。而放射+毛冬青小鼠的平均速度及在目标区域的运动距离均有所增加，第1 次进入目标区域的时间缩短。这表明放射后动物多处于多动与焦虑状态，相对于放射组小鼠，毛冬青干预后焦虑状态得到改善。避暗实验操作简单，且便于观察，被广泛地用于动物学习和记忆能力的测试[15]。本实验中放射后小鼠的EL明显缩短，错误次数明显增加；与放射组相比，毛冬青干预后小鼠的EL有所延长，错误次数也有所减少，并且接近对照组水平。进一步表明毛冬青对放射诱导的脑损伤小鼠的认知功能具有保护作用。因此，从行为学实验结果中可以推测，放射能引起小鼠学习记忆功能障碍，经毛冬青治疗后小鼠的空间学习、记忆能力得到改善，表明毛冬青可以有效改善放射性脑损伤小鼠的记忆认知功能障碍。

海马是与认知功能密切相关的脑区，具有获取、形成、维持记忆等多种功能，其中包含多种模式识别受体，容易受到炎症介质的影响，造成神经元、神经胶质细胞损伤，导致机体认知功能障碍[16]。胶质细胞的功能复杂且多样化，除了作为填充物质存在于各个神经元之间，还参与调控神经前体细胞增殖分化、轴突延伸与重塑及记忆睡眠等生理行为[17]。有研究显示，神经胶质细胞对维持脑内稳态、调节神经元功能和维持大脑认知过程起到关键作用[18-19]。小胶质细胞是中枢神经系统中最重要的免疫细胞，可以诱导星形胶质细胞活化，并调控其功能活动，且海马是小鼠大脑中小胶质细胞密度最高的结构之一[20]。大量研究证实，小胶质细胞活化释放的大量炎性介质，如IL-1β、IL-6等，是神经元损伤的关键因子，可导致认知功能障碍[21-22]；同时，星形胶质细胞定位的连接蛋白与记忆的形成和恶化密切相关，生理情况下参与了记忆的形成，而病理情况下星形胶质细胞的激活可能导致神经元损伤和认知能力下降，且对海马神经的发生起调控作用[23-24]。而Iba-1和GFAP作为两种神经胶质细胞的特异性标志蛋白，其表达水平反映了神经胶质的功能活化状态，对认知功能的影响也尤为重要。据文献报道，射线在治疗头颈部肿瘤患者时，也可能造成神经胶质细胞不同程度的损伤[25]。本研究通过HE 染色发现，放射后海马区组织结构发生了病理学改变，而毛冬青治疗后得到缓解；而免疫荧光实验发现，放射后小鼠脑组织中Iba-1和GFAP阳性表达水平显著增高，小胶质细胞体积增大，细胞突起增粗、增长；星形胶质细胞排列密集、胞体增大，突起变粗。毛冬青干预后，小胶质细胞与星形胶质细胞的活化被抑制，Iba-1 和GFAP 阳性表达水平降低，这提示放射改变了Iba-1 和GFAP 的表达水平，影响了小胶质细胞和星形胶质细胞的功能状态，造成了机体认知能力的下降，而毛冬青可能通过保护小鼠海马区细胞组织结构，调节放射性脑损伤小鼠神经胶质细胞的状态，从而改善小鼠的认知功能障碍。

综上所述，毛冬青对放射性脑损伤认知功能具有保护作用，其机制可能与抑制神经胶质细胞活化有关。毛冬青作为一种常见的天然中草药，来源广泛，价格低廉，本研究为临床上治疗放射性脑损伤提供了新的思路。后续将对其潜在的分子机制以及途径进行更深入的研究。