中性粒细胞胞外诱捕网在系统性红斑狼疮相关间质性肺病中的作用

孙宇石，杨森，林慧庆*

(1武汉大学人民医院胸外科，武汉430060；2武汉大学第一临床学院，武汉430060)

间质性肺病(interstitial lung disease，ILD)是许多自身免疫病的常见并发症，虽然系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)患者并发ILD的发病率较低(1%～15%)，但ILD严重影响了患者的生活质量，增加了死亡风险[1]。SLE病程超过10年、50岁后发病、反复发作的急性狼疮肺炎病史[2]、雷诺现象、抗核糖核蛋白(ribonucleoprotein，RNP )抗体、硬化症和甲襞毛细血管镜检查异常的患者更易患SLE-ILD[3]。

白细胞介素-8(interleukin-8，IL-8) 浓度增高可作为活动性SLE和 SLE-ILD的有效生物标志物[4]，且IL-8水平与肺纤维化的严重程度相关[5]。作为中性粒细胞的强效趋化剂与激活剂，IL-8与肺纤维化的相关性提示了中性粒细胞与肺纤维化的相关性。

中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps，NETs)是中性粒细胞在体外特定刺激下形成的一种纤维网状结构[6]，其主要成分为DNA和组蛋白，除了具有杀灭病原微生物的作用外，还可能参与自身免疫反应。在SLE患者多部位组织活检中发现NETs存在[7,8]，因此NETs在结缔组织病及ILD中的作用逐渐被重视。

1 NETs的基本介绍

Brinkmann等[6]在体外利用佛波酯(phorbol myristate acetate，PMA)、脂多糖((lipopolysaccharide，LPS) 或IL-8刺激被分离出的中性粒细胞，可形成一种胞外纤维网状结构，即NETs。DNA是NETs的主要成分[6]，肽基精氨酸脱亚胺酶4(peptidylarginine deiminase 4，PAD4)、中性粒细胞弹性蛋白酶(neutrophil elastase, NE)、髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP)、瓜氨酸组蛋白(citrullinated histone H3，citH3)、内源性抗菌肽LL-37[9]、胞质蛋白[10]、白细胞介素-17(interleukin-17，IL-17)等也参与了NETs的构成。NETs形成的过程称为中性粒细胞胞外诱捕网形成或凋零(NETosis)。目前普遍认为NETosis是细胞的一种死亡途径。根据刺激物的不同和过程的差异，目前认为NETosis有3种形式。

1.1 自杀式NETosis

在PMA、自身抗体或胆固醇结晶的刺激下，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)氧化酶被蛋白激酶C(protein kinase C，PKC) /Raf/丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase kinase，MEK)/细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases, ERK)通路激活并产生活性氧(reactive oxygen species，ROS)，并在辅因子Ca2+的辅助下激活PAD4，导致染色体解聚[10]。同时NE和MPO转移到细胞核中破坏核膜，释放染色质到胞质中并被颗粒蛋白和细胞质蛋白修饰。最后，NETs 通过破坏的质膜释放，中性粒细胞死亡[11]。此途径中ROS的产生对于激活PAD4至关重要，所以被称为NOX依赖性途径[12]。

1.2 活性NETosis

该方式由补体受体(complement receptor 3，CR3)或Toll样受体2(Toll-like receptors 2，TLR2) 诱导，也可直接通过Toll样受体4(toll-like receptors 4，TLR4) 或间接通过由TLR4 激活的血小板诱导。PAD4以不依赖ROS的途径被激活，并诱导染色质解聚，同时NE破坏核膜。与自杀式不同的是，染色质通过囊泡排出，质膜保持完整，中性粒细胞仍具有生物活性[11]。

1.3 伴线粒体DNA释放的活性NETosis

在粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和LPS或补体因子5a刺激中性粒细胞的情况下，线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)以依赖ROS的方式被释放到细胞外[13]，该过程不影响中性粒细胞的功能和寿命[14]，是先天免疫的重要组成部分，但具体的分子机制还需要进一步研究。

急性创伤和后续手术患者中性粒细胞中检测出NETs生成，经实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR)证实由mtDNA组成，并且含有大量超氧化物[15]。在肺移植后原发性移植物功能障碍和化学诱导肺损伤过程中也存在mtDNA释放增加。mtDNA是细胞损伤标志物和炎症反应诱导剂，通过Toll样受体9(Toll-like receptors 9，TLR9)促进了自杀式NETosis的形成，导致严重的组织损伤[16,17]。

NETs是具有生物活性的纤维网状结构，依赖其生物及物理性质在抵抗病原微生物方面发挥了提高抗菌物质浓度、减少毒力因子和杀灭细菌、作为物理屏障限制细菌传播和减少蛋白酶等物质对于临近组织损伤的作用。但是，NETs是一把双刃剑，组蛋白复合物的释放可能会导致自身免疫病[6]。

2 NETs在SLE-ILD发病机制中的作用

2.1 NETs与SLE的关系

在SLE患者血清中普遍存在的核糖核蛋白免疫复合物(ribonucleoprotein immune complexes，RNP-IC)介导的NETosis在SLE发病机制中有重要作用。由于SLE样本中ROS 产生受损[18]，所以氧化的mtDNA依赖线粒体ROS被释放至细胞外[19]。SLE患者中存在独特的低密度粒细胞 (low-density granulocytes，LDG)，具有更强的自发性NETosis能力[20]，导致更多mtDNA、LL-37和 IL-17的暴露[21]，进一步增加了NETosis的发生率。胞外的mtDNA通过环鸟甘酸-腺苷酸合酶(cyclin GMP-AMP synthase，cGAS)-干扰素基因刺激蛋白(stimulator of interferon genes，STING)途径刺激浆细胞样树突状细胞中Ⅰ型干扰素(interferon，IFN)的信号转导[22]，导致靶细胞释放的炎症细胞因子显著增加。

NETs的主要成分为DNA，可被脱氧核糖核酸酶(deoxyribonuclease，DNase)降解。DNase1 抑制剂的存在，或抗体与NETs结合从而阻止 DNase1进入NETs都可能导致NETs降解被抑制。NETs的清除受损导致NETs-IgG免疫复合物形成，自身抗体产生增多。NETs清除异常可能参与了狼疮肾炎的形成[23]。

2.2 NETs与肺纤维化的关系

在博来霉素(bleomycin，BLM)诱导的肺纤维化模型中检测到支气管肺泡灌洗液中性粒细胞数量升高，且肺组织免疫荧光染色可观察到NETs 的出现，表明中性粒细胞的迁移和 NETs 的形成参与了肺纤维化进程[24]。

使用PAD抑制剂可抑制NETosis、减轻肺纤维化程度；PAD基因敲除小鼠的炎性基因(IL-6、IFN-γ、TNFα)表达、纤维化基因(CTGF、FGF2、Eln、Fn1、ColⅠa1、TGF-β1、α-SMA)表达及肺纤维化程度均降低[24]。因此可以推断NETs需依赖PAD4实现促纤维化和促炎作用。DNase处理的中性粒细胞产生解整合素金属蛋白酶1(recombinant A disintegrin and metalloprotease 1，ADAM1)、α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)、结缔组织生长因子2(connective tissue growth factor，CCN2)明显降低，分泌胶原蛋白的肌成纤维细胞[25]分化减少。

转化生长因子-β1 (transforming growth factor-β1，TGF-β1) /Smad2/3通路是TGF-β参与纤维化的经典通路[26]，且是抗纤维化药物吡非尼酮的作用靶点[27]。PAD4基因敲除小鼠经BLM刺激后TGF-β1表达下调[24]，但阻断TGF-β1对NETs诱导的α-SMA表达无影响[7]。因此至少存在另一条通路与TGF-β1通路并列位于NETs的下游，共同参与肺纤维化的形成过程。

2.3 NETs与SLE-ILD 的关系

IL-8是中性粒细胞的强效趋化剂和激活剂[5]，与CXC趋化因子受体1/2(CXC chemokine receptor1/2，CXCR1/2)结合可促进炎症反应、血管生成、有丝分裂和增殖[28]。IL-8可作为活动性SLE和 SLE -ILD的有效生物标志物[4]，且IL-8的水平与肺纤维化的严重程度相关[5]。IL-8是沙度利胺改善肺间质纤维化的作用靶点[29]。另外，IL-8/CXCR2 轴诱导 NETs 生成，通过不同的下游通路参与了动脉粥样硬化[28]、乳腺癌、慢性淋巴性白血病[30]等疾病的进程。

皮肌炎(dermatomyositis，DM) /多发性肌炎(polymyositis，PM)患者存在LL37和血浆游离DNA依赖性的NETs增多[31]。NETs通过TLR9/微小核糖核酸7(microRNA7, miR7)/Smad2信号通路，参与人肺成纤维细胞的增殖及其向肌成纤维细胞的分化，促进了肺纤维化形成[32]。另外，DM/PM-ILD的患者血清DNase1活性显著降低。NETs下游通路的过度激活和清除异常共同导致了多发性肌炎相关间质性肺病(polymyositis-ILD，PM-ILD)的形成。

在非特异性间质性肺炎(nonspecific interstitial pneumonia，NSIP)患者的肺组织活检中，α-SMA阳性的成纤维细胞附近发现了NETs[7]。由于各种自身免疫病的机制联系密切，且SLE-ILD与PM-ILD的病理类型都是NSIP，所以NETs的清除异常很可能也是SLE-ILD的机制。

在活动性SLE炎症微环境条件下，缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)和内皮素-1(endothelin-1，ET-1)诱导中性粒细胞表达应激反应蛋白(regulated in development and DNA damage responses 1，REDD1)，通过REDD1/自噬/NETs/组织因子(tissue factor,TF)/凝血酶轴参与了SLE 的终末器官损伤，NETs中的成分白细胞介素-17A(interleukin-17A，IL-17A)参与了纤维化进程[8]。HIF-1α和ET-1诱导的REDD1/自噬/NETs 轴可能为SLE-ILD的上游通路，增加NETs生成；与PM-ILD相似，SLE-ILD中很可能也存在DNase活性降低从而使NETs清除受阻。积累的NETs通过TF/凝血酶轴和 IL-17A 参与组织炎症和纤维化，导致SLE终末器官损伤。

在SLE背景下RNP-IC诱导NETs和mtDNA释放[12]，一方面导致中性粒细胞线粒体功能障碍，线粒体来源的ROS增多，激活TGF-β参与ILD形成；另一方面mtDNA释放至胞外，通过cGAS-STING途径增加干扰素α(interferon-α , IFN-α)分泌，加重了SLE的组织损伤[33,34]。

3 NETs相关治疗

3.1 重组人DNase

重组人DNase已被批准用于少数肺部疾病的治疗，但需考虑长期使用的副作用[35]。免疫吸附治疗[23]、替代性核酸酶和糖皮质激素对于改善DNase1活性有一定的效果[31]。

3.2 ROS清除抑制剂

在动物实验中已证实ROS清除剂可抑制线粒体ROS，降低SLE程度和Ⅰ型IFN反应[12, 19]，并改善肺纤维化。

3.3 阻断ET-1、HIF-1α/REDD1/自噬/NETs通路的药物

ET-1受体拮抗剂(如波生坦)和 HIF-1α 抑制剂(如 L-抗坏血酸)，自噬抑制剂(如羟氯喹)，针对IL-17A(如苏金单抗)和 TF/凝血酶轴(如凝血酶抑制剂)的药物是针对该通路各靶点的潜在有效药物[8]。

3.4 PAD4抑制剂

PAD4抑制剂可显著下调Ⅰ型IFN调节基因的表达[36]，但同时可能导致SLE模型中还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶(nicotinamide adenine dinucleotide oxidase，NOX)来源的ROS减少[18,19]，有加重疾病的风险。

4 总 结

NETs在SLE-ILD 的发病机制中发挥了重要的作用。SLE炎症微环境中的ET-1、HIF-1α/REDD1/自噬轴和RNP-IC分别促进了NETs的释放，同时DNase1的活性降低使NETs无法有效清除，导致mtDNA的胞外积累、ROS产生、TGF-β1激活，并依赖cGAS/STING/IFN-α途径和TF/凝血酶途径参与组织炎症，依赖IL-17A和其他可能机制参与纤维化。因此进一步探索NETs相关通路与SLE-ILD的关系至关重要，未来需要更多临床前及临床研究加以论证。