RaeX蛋白在鸭疫里默杆菌耐受重金属离子中的作用分析

秦明星，宫晓炜，陈启伟，王燕萍，权 衡，朱雨佳，郑福英，蔺国珍

(1.西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030；2.中国农业科学院 兰州兽医研究所 家畜疫病病原生物学国家重点实验室，甘肃 兰州 730046)

许多重金属离子(Fe、Mn、Zn、Co、Ni等)是细菌的必需营养物质，对于细菌的生命活动发挥着至关重要的作用，比如参与细菌的生长、多种酶类的功能等[1-2]。细菌可通过各种途径和机制获得重金属离子，以维持自身的生存；另一方面，过量的重金属离子累积在细胞内会对细菌产生毒性[3-4]。细菌进化出了复杂的机制来维持自身体内外重金属离子的平衡，其中金属离子外排泵发挥了重要作用[5-6]。

鸭疫里默杆菌是一种革兰阴性菌，导致雏鸭的浆膜炎，是严重危害养鸭业生产的一种细菌病原。该菌的基因组中标注多种类型的外排泵，目前的研究已经鉴定一种主要易化子超家族(major facilitator super family，MFS)Rant蛋白[7]，耐药结节细胞分化家族(resistance nodulation and cell division，RND)RaeC-RaeA-RaeB和RaeE-RaeF-RopN外排泵[8-9]，以及一种ATP结合盒家族(ATP binding cassette，ABC)外排泵[10]，这些外排泵具有不同的底物谱，均与菌株的耐药性相关。RND外排泵是3种蛋白组成的复合物，包括内膜蛋白(inner membrane protein，IMP)外膜蛋白(outer membrane protein，OMP)和周质膜融合蛋白(membrane fusion protein，MFP)[11]。这3种蛋白可以位于同一个操纵子内，或者内膜蛋白和周质蛋白位于同一个操纵子内，而外膜蛋白位于其他位置。

鸭疫里默杆菌RA-LZ01株的基因组中注明，GE296_RS01445-GE296_RS01450-GE296_RS01-455编码一个3组分蛋白的RND外排泵，将其命名为RaeX-RaeY-RopM，其中GE296_RS01445、GE296_RS01450和GE296_RS01455分别对应于内膜蛋白RaeY、外膜蛋白RopM和周质蛋白RaeX。本课题组在前期研究中构建了RA-LZ01菌株的GE296_RS01450基因编码的RopM蛋白缺失株，首次发现该蛋白灭活后菌株对重金属离子Ni、Mn和Co的敏感性显著上升，但菌株的耐药表型无任何改变，说明RaeX-RaeY-RopM外排泵与鸭疫里默杆菌的重金属离子耐受相关，而与其耐药性无关[7]。本研究进一步验证GE296_RS01455基因编码的RaeX蛋白是否在RA-LZ01菌株耐受重金属离子中发挥作用。

1 材料与方法

1.1 菌株和质粒鸭疫里默杆菌RA-LZ01(GenBank登录号：NZ_CP045564.1)和LJW-2菌株保存于中国农业科学院兰州兽医研究所草食动物细菌病创新团队；大肠杆菌X7213和自杀质粒pRE112购自NTCC国家典型培养物保藏中心；穿梭质粒pCPRA由本实验室构建；大肠杆菌Trans-1感受态细胞购自北京全式金公司。

1.2 培养基和试剂胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)、胰蛋白酶大豆琼脂(TSA)购自美国 BD difcoTM公司；LB肉汤购自英国Oxoid 公司；琼脂粉和抗生素购自北京索莱宝科技有限公司；2,6-二氨基庚二酸(DPA)购自东京化成工业株式会社；重金属试剂购自上海麦克林生化科技有限公司；限制性内切酶 SacⅠ、SphⅠ、PstⅠ、T4连接酶，质粒提取试剂盒，胶回收试剂盒均购自TaKaRa公司；细菌RNA提取试剂盒购自北京全式金生物技术公司；0.22 μm 无菌硝酸纤维素膜和过滤器购自美国 Millipore公司；SYBR qPCR Master Mix和HiScriptⅡ Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)购自南京诺唯赞生物科技有限公司。

1.3 引物设计本研究中所用的引物及扩增的目的DNA片段见表1，引物由西安擎科生物有限公司合成。

1.4 构建GE296_RS01455基因缺失株Δ1455如表1中所列，以亲本株RA-LZ01株的基因组为模板，以1455-U-F/1455-U-R和1455-D-F/1455-D-R为引物，扩增GE296_RS01455基因的上游同源臂(UP-HA)和下游同源臂(DO-HA)；以菌株LJW-2基因组为模板，以Erm-F/Erm-R为引物扩增ermF抗性基因；通过重叠PCR将UP-HA、ermF基因和DO-HA依次进行融合，构建打靶片段(该片段包括GE296_RS01455基因上游同源臂620 bp，ermF抗性基因801 bp以及下游同源臂601 bp)；用SacⅠ和SphⅠ酶将打靶片段克隆进自杀质粒pRE112，重组质粒转化进大肠杆菌X7213化学感受态细胞中，利用含50 mg/L DPA、25 mg/L氯霉素的LB固体培养板进行筛选，随后用引物1455-U-F/1455-D-R进行PCR鉴定，并将扩增到的PCR产物进行测序，得到的阳性菌株即为供体菌，命名为X7213-pRE112-1455。

表1 PCR引物名称、序列及扩增DNA片段

参照文献[7-8]，通过结合转移和同源重组的方法构建GE296_RS01455基因缺失株。利用含2 mg/L 红霉素和5 mg/L多黏菌素B的TSA平板进行筛选，得到的单菌落增菌后，用引物OmpA-F/OmpA-R、1455-U-F/1455-D-R、1455-F/1455-R和Erm-F/Erm-R进行PCR鉴定，并将引物1455-U-F/1455-D-R扩增到的PCR产物进行测序，得到的缺失株命名为Δ1455。

1.5 构建GE296_RS01455基因回复株cΔ1455以亲本株RA-LZ01株的基因组为模板，以引物1455-F/1455-R扩增GE296_RS01455基因，用PstⅠ和SphⅠ酶将目的DNA片段克隆进穿梭质粒pCPRA，将重组质粒转化进X7213，用含有50 mg/L 氨苄青霉素的TSA平板进行筛选，并用OmpA-F/OmpA-R和1455-F/1455-R引物进行PCR验证，得到的供体菌命名为X7213-pCPRA-1455。将供体菌与GE296_RS01455基因缺失株Δ1455共培养，利用结合转移的方法将重组穿梭质粒导入Δ1455中，用含有1 mg/L孢西丁的TSA平板进行筛选，并用OmpA-F/OmpA-R和1455-F/1455-R引物进行PCR验证，恢复株命名为cΔ1455。具体操作方法见文献[7-8]。

1.6 生长曲线测定分别将RA-LZ01和Δ1455菌株接种至5 mL TSB液体培养基中，37℃ 200 r/min培养至D600值约1.0，并测定每个菌株的CFU，调整每个菌株的起始浓度均为109CFU/mL。分别取0.1 mL 菌液接种至10 mL TSB液体培养基中，即每个菌株的接种量均为108CFU。37℃ 200 r/min培养，每隔1 h取130 μL菌液用紫外分光光度计测量其D600值，共测定12 h。每个菌株做3组平行试验[12]。

1.7 重金属离子耐受性试验将经121℃，20 min高压的TSA培养基冷却至40℃左右，分别加入AgCl、ZnSO4、BaSO4、FeSO4、MnCl2、CuSO4、NiCl2、CoCl2、CaCl2、MgSO4共10种重金属试剂，分别配置成含不同浓度金属离子的培养板，各金属离子的浓度如下：AgCl(0.21×10-3～1.46×10-3mol/L)；ZnSO4(0.11×10-3～0.70×10-3mol/L)；BaSO4(0.13×10-3～0.86×10-3mol/L)；FeSO4(0.16×10-3～1.32×10-3mol/L)；MnCl2(0.24×10-3～1.59×10-3mol/L)；CuSO4(0.12×10-3～0.80×10-3mol/L)；NiCl2(0.23×10-3～1.54×10-3mol/L)；CoCl2(0.13×10-3～0.84×10-3mol/L)；CaCl2(0.18×10-3～1.80×10-3mol/L)；MgSO4(0.17×10-3～1.66×10-3mol/L)。将新鲜菌液以1∶100比例重新转接后，增菌至D600值约1.0，以10倍系列稀释，测定每株菌每个稀释度的CFU，并调整每株菌的菌液浓度为10～106CFU/mL，依次取10～106CFU/mL的菌液，每个菌液样本取5 μL进行点板，将TSA平板在CO2培养箱中37℃培养18～24 h，观察菌落生长状况。

1.8 实时定量RT-PCR为了确定在不同重金属离子的刺激下，GE296_RS01455基因的转录水平，将亲本株分别在含CoCl2(0.42×10-3mol/L)，NiCl2(1.54×10-3mol/L)和MnCl2(1.59×10-3mol/L)的TSB中培养至D600值约为1.0，用细菌RNA提取试剂盒提取总RNA,然后用gDNA wiper 反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA，作为模板备用。qRT-PCR 反应体系为20 μL，反应条件：95℃ 30 s；95℃ 10 s，60℃ 30 s，40次循环。以特异性引物GAPDH-F/GADPH-R，q1455-F/q1455-R分别扩增GAPDH和GE296_RS01455基因，其中GADPH基因作为内参。通过2-△△Ct方法计算相对基因表达量，并进行差异性分析[13]。

2 结果

2.1 缺失株△1455和回复株c△1455的构建结果用引物OmpA-F/OmpA-R、1455-U-F/1455-D-R、Erm-F/Erm-R和1455-F/1455-R对缺失株进行PCR鉴定，前3对引物扩增出目的条带，同时第4对引物扩增不出目的条带即为缺失株(图1A)。将1455-U-F/1455-D-R引物扩增到的PCR产物进一步测序，证实GE296_RS01455基因缺失株△1455构建成功。

以引物OmpA-F/OmpA-R，1455-F/1455-R对回复株进行PCR鉴定，2对引物同时扩增出目的片段即为回复株(图1B)。将1455-F/1455-R引物扩增到的PCR产物进一步测序，证实基因回复株c△1455构建成功。

M.DL2000 DNA Marker；1.OmpA基因(1 119 bp);2.ErmF 基因(801 bp);3.包含UP-HA、ermF、DO-HA 的GE296_RS01455(2 022 bp)基因片段;4.GE296_RS01455(1 137 bp)

2.2 生长曲线为证明GE296_RS01455基因的缺失是否影响菌株的生长速率，测定了亲本株RA-LZ01和缺失株△1455在生长12 h内的D600值，并制定生长曲线。结果显示，与亲本株RA-LZ01相比，缺失株△1455在2～4 h内生长速率降低，但4～12 h内的生长速率无明显变化(图2)。

图2 亲本株RA-LZ01和缺失株△1455的生长曲线

2.3 菌株对重金属离子的耐受性重金属离子点板试验结果显示，在不同重金属离子浓度下，与亲本株RA-LZ01相比，缺失株Δ1455对CuSO4、ZnSO4、AgCl、BaSO4、FeSO4、CaCl2、MgSO4的耐受性均没有发生改变，但对1.59×10-3mol/LMnCl2、1.54×10-3mol/LNiCl2和0.42×10-3mol/L CoCl2的敏感性显著升高；回复株cΔ1455部分恢复了对MnCl2、NiCl2和CoCl2的耐受。该结果说明GE296_RS01455基因介导菌株RA-LZ01对重金属Mn、Ni和Co的耐受(图3)。

图3 菌株对重金属离子的耐受性

2.4 实时定量RT-PCR通过实时荧光定量RT-PCR结果分析，在MnCl2的作用下，亲本株RA-LZ01中GE296_RS01455基因的相对转录水平无显著变化；在NiCl2和CoCl2的作用下，GE296_RS01455基因的相对转录水平分别提高了24和20倍(图4A)。然而，在MnCl2、NiCl2和CoCl2作用下，回复株c△1455中GE296_RS01455基因的相对转录水平均无明显变化(图4B)。

注：*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；NS差异不显著

3 讨论

鸭疫里默杆菌是一种杆状或椭圆状、可形成荚膜的革兰阴性菌，属于黄杆菌科，里默菌属[14]。该菌主要感染0～5周龄的雏鸭，可通过呼吸道、皮肤伤口和消化道等多种途径导致雏鸭的浆膜炎和脑膜炎，发病鸭具有较高的死亡率，给养鸭业造成重大经济损失[15]。鸭疫里默杆菌具有多种血清型，各血清型之间无交叉保护，给疫苗防控策略带来很大障碍。目前养殖业中应用的是血清1和2型二价灭活苗，以及血清1，2和7型三价灭活苗。根据流行病学调查，目前我国流行的鸭疫里默杆菌除了以上血清型，还有其他血清型菌株，导致疫苗免疫效果较差[16]。因此，实际养殖中主要以抗生素防治为主，但在抗生素的压力下，耐药菌株不断出现，需要对鸭疫里默杆菌的耐药机制开展研究，以提高抗生素的应用效果，并为开发新型药物提供靶标[17]。

外排泵是介导细菌耐药的重要机制，尤其是RND外排泵广泛存在于革兰阴性菌中，并且该种外排泵的底物谱非常宽泛，包括抗生素、去污剂、有机溶剂、消毒剂、重金属等[18-19]。本课题组前期对鸭疫里默杆菌的外排泵进行鉴定时，发现RA-LZ01株的1个RND外排泵RaeX-RaeY-RopM，将其外膜蛋白RopM(GE296_RS01450基因编码)缺失后，菌株对9类共22种抗生素、去污剂、有机溶剂以及消毒剂的敏感性均无改变，并且菌株的生长速率也无明显改变，说明该外排泵与菌株的耐药性和生长能力无关[7]。进一步研究发现，RopM蛋白灭活导致菌株对MnCl2、NiCl2和CoCl2的敏感性显著升高，首次发现鸭疫里默杆菌中存在与重金属离子耐受相关的外排泵。

RND外排泵的每一个组分都是必需的，每一个蛋白的缺失都会导致RND外排泵失去功能，但外膜蛋白灭活后可能会有其他外膜蛋白进行代替[20]。基于上述发现，本课题组进一步对编码内膜蛋白RaeY的GE296_RS01445基因进行定向缺失，但经过多次试验，始终无法得到该蛋白的全部或部分缺失株，说明RaeY是鸭疫里默杆菌的必需蛋白，灭活后将导致菌株死亡[7]。

本研究对编码周质蛋白RaeX的GE296_RS01455基因进行定向缺失，对菌株的生长速率，菌株对MnCl2、NiCl2和CoCl2的耐受性，以及GE296_RS01455基因在MnCl2、NiCl2和CoCl2压力下的转录水平进行检测，发现RaeX蛋白灭活后菌株也表现出与RopM蛋白灭活株相同的性状，说明RaeX与RopM蛋白在RaeX-RaeY-RopM外排泵中均发挥功能。另外，恢复株中的GE296_RS01455基因在MnCl2、NiCl2和CoCl2压力下转录水平无明显变化，可能与该基因位于穿梭质粒上有关，所用的启动子与亲本株不同，也无法提供与亲本株一致的调控网络。

目前发现的能外排重金属离子的细菌RND外排泵较少，主要有大肠杆菌中能够有效的排出细胞周质和细胞质中的Cu和Ag离子的CusCBA外排泵[21]，外排Ni和Co离子的RcnB外排泵[6]；耐重金属根瘤菌中能够有效排出Zn离子的ZneA外排泵[22]；铜绿假单胞菌中能够排出细胞周质与细胞质内的Zn、Cd和Co离子的CzcCBA外排泵[23]；猪链球菌中外排Fe和Co离子的PmtA[5]以及外排Mn离子的MntE等[24]。本研究发现鸭疫里默杆菌中外排Mn、Ni和Co离子的RND外排泵，丰富了对细菌外排重金属离子的理解。