不同检测方法对甜菜SCoT和DAMD扩增产物多态性的影响

梁雪梅，吴则东

(1.黑龙江大学现代农业与生态环境学院，哈尔滨 150080；2.黑龙江省普通高校甜菜遗传育种重点实验室/黑龙江大学，哈尔滨 150080)

0 引言

食糖除了可以从广泛种植于热带的糖料作物甘蔗中提取，还能从温带糖料作物甜菜中获取，且大约四分之一的食糖都提取自甜菜栽培变种糖甜菜。同时糖甜菜作为我国北方的重要经济作物和糖料作物，其产区主要集中在新疆、内蒙古及黑龙江，总种植面积和总产量约占全国 90%左右[1]。然而目前我国几乎100%的甜菜生产用种都依靠进口，国内自主培育生产的品种占市场的比率几乎可以忽略[2]，国外进口的种子多为经过处理的丸粒化种子，且市场上偶有品种张冠李戴或者品种纯度不够等现象发生，致使品种的品质难以保证，会对农户生产造成一定的损失，所以发展快速鉴定甜菜品种真伪的技术，具有重要意义。分子标记技术就是能快速鉴定甜菜品种真实性的有效手段之一。

目前，分子标记技术经过几十年的发展，已被应用于甜菜的品种鉴定、遗传图谱构建、QTL定位和遗传多样性分析等方面，目前已经应用于甜菜的分子标记技术包括如RFLP[3]、RAPD[4]、ISSR[5]、SSR[6,7]、InDeL[8]、DAMD[9,10]和SCoT[11]等。而DAMD 和SCoT 作为新型的分子标记，近几年在国内外开始应用于作物遗传育种的各个方面。定向扩增小卫星DNA (Direct Amplification of Minisatellite DNA by PCR, DAMD) 是Health[12]等在1993年提出的，该标记是从野生水稻品种的重复序列中选择出来的，标记通常有约20个核苷酸，多态性高，重复性好。该技术已被运用于无花果[13]、花生[14]、扁豆[15]、黄瓜[16]等植物遗传育种的各方面的研究中。目标起始密码子多态性标记(start condon targeted polymorphism，SCoT)是Collard 和Mackil[17]于2009年提出的，是一种基于翻译起始位点 (ATG) 的目的基因标记，多态性丰富。已在饲用燕麦[18]、甘薯[19]以及小麦[20]等农作物的遗传多样性分析、指纹图谱构建等方面得到应用。这两种引物的多态性都十分丰富，分辨率高，都可用琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。

早有研究表明不同的凝胶电泳对PCR扩增产物的多态性存在一定的影响。李新海等[21]首先利用3% 琼脂糖凝胶和12%的聚丙烯凝胶酰胺电泳对SSR 扩增产物进行分离，结果表明琼脂糖凝胶电泳更适于遗传作图和基因定位的研究，聚丙烯酰胺凝胶电泳则可用于遗传多样性和构建指纹图谱的研究；而孙燕红等[22]利用26条DAMD 引物和12个甜菜品种，对比2%的琼脂糖凝胶和6%聚丙烯酰胺凝胶电泳对扩增产物多态性的影响时，则发现琼脂糖凝胶电泳与聚丙烯酰胺凝胶电泳对扩增产物多态性显现结果无显著差异；谢小燕等[23]采用2%琼脂糖凝胶电泳和5%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对ISSR-PCR产物进行检测，证实了5%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳可获得更可靠的遗传图谱，2%琼脂糖凝胶电泳检测更适合前期的ISSR引物的筛选。

由于前人相关的甜菜DAMD[22,24]和SCoT[11]的实验扩增产物检测中既有使用6%和8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶，也有利用2%琼脂糖凝胶的，因此并不确定哪种凝胶电泳方法及浓度检测DAMD和SCoT扩增产物多态性的效果最好。且至今国内外尚未见同时利用不同浓度琼脂糖凝胶电泳，以及不同浓度非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对甜菜DAMD-PCR和SCoT-PCR的扩增产物进行对比检测的相关报道。因此，试验在前人的基础上以8个不同的甜菜品种对7条DAMD引物和15条SCoT 引物进行筛选，选出多态性最好，分辨率最高的核心引物；再利用不同浓度的琼脂糖凝胶和非变性聚丙烯酰胺凝胶两种电泳方法对甜菜基因组扩增产物的多态性的影响进行对比分析，选出甜菜DAMD和SCoT引物扩增产物多态性检测的最优方法，为甜菜品种指纹图谱构建以及高效、快速地对甜菜品种真实性鉴定奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验选择8个来自法国SES VanderHave 公司、美国BETASEED公司、丹麦Maribohilleshög ApS公司、德国KWS SAAT SE 公司以及中国吉林省农业科学院的甜菜登记品种作为供试材料，甜菜品种具体信息见表1。

表1 试验材料Tab.1 Test materials

试验所选择多态性较好的7条DAMD引物和15条SCoT 引物来自黑龙江大学甜菜分子实验室，是在前人研究的基础上确定的。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，经过HAP纯化，引物稀释为10 μmol/L，备用。具体序列见表2。

表2 试验所选引物名称与序列Tab.2 Primer names and sequences selected for the test

1.2 试验方法

1.2.1 DNA提取

将所选的8个甜菜品种种植在黑龙江大学甜菜育种改良中心，待其幼苗生长出2片真叶，即可进行DNA提取。参考王宇晴等[25]改良的CTAB法提取甜菜品种的基因组DNA，测定完DNA的纯度和浓度后，用ddH2O将其浓度稀释为10 ng/μL，备用。

1.2.2 引物扩增体系与程序

PCR扩增的总体系为5 μL，其中包含正反向引物0.4 μL(10 pmol/L)，2×MIX(2*Rapid Taq Master Mix)2.5 μL，ddH2O 1.1 μL，模板DNA 1 μL(10 ng/μL)。

DAMD引物和SCoT引物的PCR 程序都是 Touchdown程序：程序为94 ℃预变性3 min，循环一次；94℃变性15 s，65℃～56℃变温退火15 s，72℃延伸30 s(65℃～56℃变温期间，每降1℃循环2次，共循环20次)；接着再进行94℃变性 15 s，55℃固定退火 15 s，72℃延伸30 s，循环 20次；72℃再延伸 5 min；16℃保存。

1.2.3 凝胶电泳检测

PCR 扩增产物，利用6%、 8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶和1%、2%的琼脂糖凝胶电泳分别进行检测，6%和 8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳时，然后在0.5×TBE缓冲液中进行恒压180 V，90 min电泳。用无毒，高效的G-red核酸染料进行泡染显影，接着用Syngene G: BOX 凝胶成像仪观察、照相记录，最后进行数据统计。

1.2.4 数据处理

以人工观察读带的方法，在相同迁移率的位置上，有条带记为“1”，无条带为“0”，记录数据并计算多态性条带。

2 结果与分析

2.1 甜菜SCoT 和DAMD核心引物筛选

利用8个来自5个育种公司的甜菜品种，对选用的7条DAMD引物和 15 条 SCoT引物进行检测筛选，对两种核心引物的筛选都遵循扩增条带清晰，多态性丰富且易识别的原则，最终确定最优的DAMD引物4条，分别为URP1F、URP2R、URP6R、URP17R；SCoT引物2条，分别为SCoT12和SCoT13，核心引物扩增产物详细信息见表3。

2.2 不同浓度的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳效果对比

DAMD和SCoT 共6条核心引物，分别用6%和8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测它们扩增产物的多态性，发现利用不同浓度的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测不同的引物，甚至同一引物的扩增产物，它们的条带总数、条带多态性和带型等方面的差异都十分显著，见图 1。

在6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测中显示，这6条核心引物扩增出多态性条带中最多的有30条，最少的也有12条，扩增产物总条带为131条，其中有130条多态性条带，总的多态性条带占比为99.2%，见表3。其中引物URP1F、URP2R、URP6R对8个甜菜品种进行扩增后，产物在非变性聚丙烯电泳效果如图1所示，其中URP2R 扩增出16条条带清晰易识别，全为多态性条带。但8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测时，产物难以分离，条带聚集，难分辨。由此可知，浓度为6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶比浓度为8%的更适用于甜菜SCoT和DAMD扩增产物多态性的检测。

图1 引物URP1F、URP2R、URP6R对8份甜菜品种扩增图注：左为6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，右为8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，M：DM 50 bp DNA Markers，1～8为品种编号，同表1Fig.1 Amplification of primers URP1F, URP2R, and URP6R on 8 sugar beet varietiesNote:The left panel shows 6% non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis, the right panel shows 8% non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis, M:DM 50 bp DNA Markers, and 1～8 are variety numbers, same as Table 1.

表3 核心引物扩增产物信息Tab.3 Information of core primer amplification

2.3 不同浓度琼脂糖凝胶电泳效果对比

分别利用1%和2%的琼脂糖凝胶检测选出的6条DAMD和SCoT的核心引物扩增产物的多态性。结果表明，用浓度不同的琼脂糖凝胶电泳检测不同引物或同一引物的扩增产物，其显示的产物分辨率、多态性和条带亮度等均有一定的差异性，见图2。其中用2%琼脂糖凝胶电泳检测6条核心引物扩增产物的多态性时，扩增总条带为57条，其中多态性条带有43条，总的多态性占比为75.4%，各个引物多态性占比范围在62.5%～85.7%，其中URP2R的多态性条带占比最高为85.7%，SCOT12的最低为62.5%，见表3。而1%的琼脂糖凝胶检测产物的条带图虽能显示一定的多态性，但条带分离较差，出现重叠的情况。所以使用琼脂糖凝胶电泳检测甜菜SCoT和DAMD扩增产物多态性时，2%的琼脂糖凝胶比1%的琼脂糖凝胶更好。

图2 利用琼脂糖凝胶电泳检测 6条核心引物对8份甜菜品种扩增图注：A为1%琼脂糖凝胶电泳，B为2%琼脂糖凝胶电泳凝胶电泳，M: DM 2000bp DNA Markers，1～8为品种编号，同表 1Fig.2 Amplification map of 8 sugar beet varieties using agarose gel electrophoresis detection with 6 core primersNote: A is 1% agarose gel electrophoresis, B is 2% agarose gel electrophoresis gel electrophoresis, M: DM 2000bp DNA Markers, 1～8 are variety numbers, same as Table 1

2.4 两种凝胶电泳效果对比

同时利用琼脂糖和非变性聚丙烯酰胺凝胶检测6 条核心引物的PCR扩增产物的多态性，发现两种凝胶电泳方法均能分离出清晰的条带，但分离显现出的总条带和多态性带的数量不同。以6%非变性聚丙烯酰胺凝胶和2%琼脂糖凝胶检测效果进行对比可知，非变性聚丙烯酰胺凝胶检测出的总条带和多态性带的数量均比琼脂糖凝胶电泳检测的高，见表 3，原因在于DAMD和 SCoT的PCR扩增特性以及两种凝胶的分辨率。6 条核心引物扩增产物在2%琼脂糖凝胶电泳中共分离出57条条带，43条多态性条带，总的多态性占比为75.4%；而在6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中检测出总条带数为131条，其中130条为多态性条带，总的多态性条带占比为99.2%。

从6%非变性聚丙烯酰胺凝胶扩增的总条带数比2%琼脂糖凝胶电泳扩增出的总条带数多了近2.3倍，而在总多态性占比中，6%非变性聚丙烯酰胺凝胶是2%琼脂糖凝胶的3倍。可看出前者具有的分辨率更高，而后者则无法显现部分DNA条带。说明6%非变性聚丙烯酰胺凝胶对分离DAMD和 SCoT扩增产物的效果更好，能更准确地反映甜菜品种的遗传信息。

3 讨论与结论

利用不同浓度的非变性聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶电泳，分别对甜菜DAMD-PCR和SCoT-PCR的扩增产物进行对比检测，由于不同浓度凝胶的分辨能力不同。所以本研究中利用6%和8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶，以及1%和2%的琼脂糖凝胶检测出的条带结果出现显著差异性，6%非变性聚丙烯酰胺凝胶和2%琼脂糖凝胶扩增出的条带总数和条带多态性都比对比浓度的更好。

不同的电泳方法的分辨率也存在差异，有研究表明聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR扩增产物时，具有比琼脂糖凝胶电泳更高的分辨率和灵敏性，能更准确地反映研究对象的遗传信息。叶春秀等[26]在利用2.5%琼脂糖凝胶和 6%的聚丙烯酰胺凝胶分析这两种电泳方法在新陆早系列材料 SSR 分析不同阶段使用效果的可行性时，发现聚丙烯酰胺分辨率高于琼脂糖凝胶电泳，扩增出的总条带数较多，能更加准确，完整地反映 SSR 标记扩增产物的信息；张彦苹等[27]以两种电泳方法检测石榴 RAPD 扩增产物的结果显示聚丙烯酰胺凝胶电泳的总条带数比琼脂糖凝胶电泳多1.5倍。本试验中6%非变性聚丙烯酰胺凝胶检测的总条带数比2%琼脂糖凝胶电泳检测出的总条带数多了近2.3倍，总多态性占比中，6%非变性聚丙烯酰胺凝胶是2%琼脂糖凝胶的3倍，可看出前者的分辨率更高，而后者则无法显现部分DNA条带。因此可以确定利用6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法比2%琼脂糖凝胶电泳检测对甜菜DAMD和 SCoT扩增产物的效果更好，更能准确地反映甜菜品种的遗传多样性信息。

品种真实性鉴定以及遗传差异分析需要准确的遗传多样性信息，而非变性聚丙烯酰胺凝胶更易获得更多数量的 DAMD和 SCoT条带，具有高多态性比率的特点，因此在甜菜的品种真实性鉴定方面优于琼脂糖凝胶电泳。但琼脂糖凝胶电泳操作简便，经济和便于观察等优点，常用于扩增产物分析检测[28]，可又因其每次检测样本数量少和分辨率较低，不能用于大量样品检测的实验中。因此可以根据具体实验的要求，选择更适合的电泳检测方法，对于利用DAMD和 SCoT引物构建甜菜品种指纹图谱构建，这种需要检测样品数量大，且需获得更准确地遗传信息的研究，更适合选用6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法，提高检测效率。

致谢

基金项目：“财政部和农业农村部：国家现代农业产业技术体系资助(CARS-170111)”。