减数分裂型粘连蛋白RAD21L和REC8在DNA双链断裂修复中的影响

乌云达来, 美 荣

(内蒙古师范大学 生命科学与技术学院，呼和浩特 010022)

减数分裂是将重组基因继承给子代的一种特殊细胞分裂，是高等动物形成卵子和精子等配子的途径。减数分裂中可观察到不同于有丝分裂的特殊染色体运动，例如，同源染色体的配对、联会及重组。在有丝分裂过程中各同源染色体独立运动，而在减数分裂过程中则会发生同源染色体配对和DNA双链断裂(double strand breaks, DSBs)介导的重组[1]。同源染色体之间的重组对在减数第一次分裂中的同源染色体精确分离极为重要。例如，在减数分裂过程中染色体的不均等分离是唐氏综合征等染色体三体病的主要发病原因，对临床诊断及治疗非常重要。

减数分裂重组由拓扑异构酶II类蛋白SPO11催化而发生的DSBs所启动[2-3]。DSBs一旦被核糖核酸酶(nucleases)切割形成游离3′-末端的DNA单链，RAD51和DMC1等早期重组中间体被招募到此部位[4]。这些蛋白通常在荧光显微镜下主要以小圆点的形状定位在染色体的未联会轴上。在小鼠细线期细胞核中RAD51和DMC1的数目最多约达到每核250小圆点[5]。在嵌入的3′-末端部位开始合成DNA时的结构称为SEI(single-end invasion intermediate)，此时RAD51和DMC1等早期重组中间体被MSH4等中期重组中间体所取代[6]。之后，在非常稳定的SEI状态下，DSBs末端的另一方单链区域与开裂部分的单链区域(相补链)进行氢键结合(2nd-end capture)，由于从各3′-末端开始合成DNA，最终形成含有2个Holliday结构的中间体dHJ(double-Holliday junction)。此时，MSH4等中期重组中间体被MLH1等晚期重组中间体所取代[7]。MLH1是交叉重组所必需的蛋白，只出现在粗线期染色体的交叉位点，而不会出现在非交叉位点。此时，每核含有约23～27个MLH1小圆点[8]。在DSBs修复过程中，形成dHJ结构并最终以交叉或非交叉重组的形式被解开[9]。在减数分裂型重组过程中，除了上述重组中间体蛋白质起修复作用之外，一些非重组中间体蛋白质，例如，RAD21L和REC8等粘连蛋白也有着不可或缺的影响。

粘连蛋白是普遍存在于真核生物中的高度保守性蛋白质复合体。哺乳类动物的有丝分裂型(通用性)粘连蛋白复合体主要由4个亚基形成环状结构，即2个染色体结构维持蛋白(structural maintenance of chromosome，SMC)家族的SMC1a和SMC3，1个a-kleisin亚基RAD21和1个基质蛋白SA1或SA2。减数分裂型粘连蛋白复合体不同于有丝分裂型粘连蛋白复合体，SMC3以外的其他3个亚基均存在减数分裂同种异型基因产物，针对SMC1a具有SMC1b，SA1或SA2具有SA3，RAD21具有REC8或RAD21L[10-14]。其中，RAD21L只存在于脊椎动物的减数分裂型a-kleisin亚基。相关研究表示，REC8不仅对姐妹染色单体的粘连至关重要，还在减数第一次分裂前期期间与RAD21L共同贡献于侧生组分(axial elements, AE)形成与联会复合体(synaptonemal complex, SC)组装的结构基础[15-17]。RAD21L和REC8在减数第一次分裂前期形成不同的粘连蛋白复合体，无论在每个染色体上的分布，还是在同源染色体之间的分布均具有独特之处[13-14,16,18]。在减数第一次分裂前期，RAD21L与REC8的功能有相同之处，也有其特殊作用，例如，在同源染色体配对的起始、同源染色体的联会、DSBs介导的同源染色体重组等减数分裂特异性染色体运动中均具有重要作用。其中，尤其是两者在同源染色体重组过程中作用的分子机制仍不清楚。

研究采用小鼠精母细胞，使用高分辨率显微镜(three dimensional structured illumination microcopy，3D-SIM)进行免疫荧光分析，观察并比较减数分裂型粘连蛋白RAD21L和REC8与重组中间体RAD51和MSH4之间的定位关系。

1 材料与方法

1.1 实验动物

C57BL/6J小鼠使用于减数分裂型粘连蛋白、重组中间体等在染色体上的定位分析。

1.2 抗体

实验采用的一次抗体：兔抗多克隆RAD21L抗体、小鼠抗多克隆RAD21L抗体、兔抗多克隆REC8抗体[14]、小鼠抗多克隆REC8抗体[19]、兔抗多克隆MSH4抗体 (ab58666)和兔抗多克隆RAD51抗体 (SC-8349, santa cruz biotechnology, dallas, TX)。通过适当的Alexa Fluor 488或者Alexa Fluor 568 (molecular probes, eugene, OR) 检测抗原-抗体复合体。

1.3 免疫荧光分析

根据Heyting和Dietrich[20]描述的方法制备成年小鼠精巢细胞悬液。将细胞置于多聚-L-赖氨酸(poly-L-lysin) 包被盖玻片上，含有2%多聚甲醛 (PFA) 的缓冲液中固定10 min[21]。盖玻片上的精巢细胞用0.2% Triton X-100通透5 min，磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 浸洗3次，每次10 min。将细胞在4 ℃环境下用封闭液适量稀释的一次抗体中孵育过夜，PBS浸洗10 min，detergent solution (5 mmol/L EDTA, 0.25% gelatin, 0.05% Triton X-100 in PBS) 浸洗10 min，再用PBS浸洗10 min。下一步将盖玻片与用封闭液适量稀释的二次抗体孵育1 h。PBS浸洗10 min，detergent solution浸洗10 min，再用PBS浸洗10 min。接着4′,6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI) 对DNA进行复染。用VECTASHIELD Mounting Medium (Vector Laboratories, Burlingame, CA) 进行封片。最后，用装有100 ×UPlanSApo NA1.40 油浸物镜 (Olympus, Tokyo, Japan) 的DeltaVision OMX (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) 3D-SIM和持有Plan Apochromat 10× and 100×/1.46 oil DIC物镜的共聚焦激光扫描显微镜 (LSM; Olympus, Lake Success, NY) 观察采集图像。所有图像用DeltaVision Soft Worx软件处理。一些图像以Z轴叠加的形式显示。

1.4 图像分析

采集的图像包含整个核的Z形截面图。对每个核的3D-SIM图像进行不同蛋白(粘连蛋白与重组中间体)荧光信号的共定位(重叠)分析。实验使用与对所有图像保持视觉上恒定的自动阈值“delta”系数相同的阈值[21]。接着使用此阈值测量Mandars共定位系数[22]。最后分析α-kleisin和重组中间体荧光信号的邻近程度的百分率。

1.5 共免疫沉淀法

首先将细胞抽提液与适量的抗RAD21L或抗REC8抗体孵育，进行旋转搅拌2 h。添加rProtein A Sepharose(GE Healthcare)后继续进行旋转搅拌1 h。利用TNE缓冲液冲洗3次得到沉淀物，对其进行SDS-PAGE分析。

1.6 蛋白印迹法

先用10% SDS-PAGE分离精巢细胞提取液以及免疫沉淀液，转印到PVDF 膜(Thermo scientific)上。接着用适量的抗RAD21L、抗REC8、抗RAD51、抗MSH4抗体孵育PVDF 转印膜。再用兔 IgG HRP标记抗体(GE Healthcare)孵育。最后用ECL Prime Western Blotting Detection(GE Healthcare)检测。

2 结果与分析

2.1 α-kleisin和重组中间体的定位特征

RAD21L对减数分裂过程中同源染色体的重组是必不可少的[23]。为探究RAD21L在重组过程中的作用机制，用抗α-kleisin(RAD21L或REC8)抗体和抗重组中间体(RAD51或MSH4)抗体对小鼠精母细胞进行免疫荧光标记，采用3D-SIM观察RAD21L与重组中间体之间的定位特征。结果显示，RAD21L和REC8的线形荧光信号均出现在同源染色体上[图1(a)(e)(i)(m)和(q)]，而早期重组中间体RAD51和中期重组中间体MSH4则以小圆点的形式出现在同源染色体之间[图1(f)(j)(n)和(r)]。其中部分RAD21L的荧光信号横跨在还未联会的同源染色体之间[图1(d)(h)和(l)]，与其相比REC8并无类似荧光信号[图1(d)(p)和(t)]。通过进一步观察RAD21L的横跨信号与重组中间体之间的关联发现：RAD21L的横跨信号往往出现在MSH4和RAD51的邻近之处[图1 (h)和(l), 箭头表示RAD21L的横跨信号]；而REC8只出现在重组中间体较远的边角之处[图1(p)和(t),箭头表示REC8的荧光信号]。由此可推测，RAD21L横跨信号出现在DSBs周围的目的可能是在DSBs周围建立具有一定稳定性的空间结构，促使DSBs的精确修复。

采用小鼠精母细胞进行免疫荧光染色技术的3D-SIM图片。(a)～(c)为采用抗RAD21L抗体(绿)和抗REC8抗体(红)；(e)～(g)为采用抗RAD21L抗体(绿)和抗RAD51抗体(红)；(i)～(k)为采用抗RAD21L抗体(绿)和抗MSH4抗体(红)；(m)～(o)为采用抗REC8抗体(绿)和抗RAD51抗体(红)；(q)～(s)为采用抗REC8抗体(绿)和抗MSH4抗体(红)。(d)(h)(l)(p)和(t)为放大图片。箭头表示两种α-kleisin的荧光定位，星号表示重组中间体的荧光定位。主图像的标尺为1 μm，放大图像的标尺为0.5 μm。图1 小鼠减数分裂型a-kleisin与重组中间体之间的定位关系Figure 1 Localization relationship between mouse meiotic a-kleisins and recombination intermediates

2.2 α-kleisin和重组中间体荧光信号的邻近程度

进一步分析两种α-kleisin与重组中间体荧光信号的邻近程度。结果显示：在进行分析的80对偶线期同源染色体上，邻近RAD51的RAD21L荧光信号程度(21.66%)远多于REC8荧光信号(12.66%)[图2(a)]。在粗线期，当MSH4出现在DSBs区域时，RAD21L与之的邻近程度进一步增加到44.02%，而REC8的邻近程度只有22.61%[图2(b)]。然而，通过共免疫沉淀法未观察到减数分裂型α-kleisin与MSH4或RAD51之间的相互作用(图3)。由此可推测，减数第一次分裂前期粗线期期间，RAD21L的主要功能是间接的协助MSH4，保证 DSBs的修复顺利完成。与之相比，REC8在DSBs的修复中起次要作用。

图2 RAD21L 和REC8 的荧光信号与重组中间体的邻近程度Figure 2 The proximities of fluorescence signals between RAD21L or REC8 and the recombination intermediates

分别利用RAD21L、REC8、MSH4和RAD51特异性抗体，对小鼠精母细胞提取液为材料制备的RAD21L和REC8的免疫沉淀物进行Western Blot分析。Input表示精巢提取液；control表示兔IgG免疫沉淀物。箭头表示没有检测到α-kleisin与重组中间体之间相互作用。图3 α-kleisin与重组中间体之间相互作用的检测Figure 3 The detection of interaction between α-kleisins and recombinant intermediates

3 讨论与结论

RAD21L是一种只存在于脊椎动物生殖细胞中的减数分裂型粘连蛋白α-kleisin亚基[12-14]，它与另一种普遍存在于所有真核生物中的减数分裂型α-kleisin亚基REC8在减数分裂过程中的表达具有很明显的时空区别[16,18-19]：在时间上，RAD21L仅表达在减数第一分裂前期的粗线期为止，而REC8一直表达在整个前期；在空间上，两者均存在于联会复合体的侧生组分和横向纤维之间，并且RAD21L定位更为内侧。由此可推测，此两种粘连蛋白可能对减数分裂型染色体运动具有独特的作用或者主次作用。REC8主要贡献于姐妹染色单体的粘连[19]，联会复合体的装配[10]，组织减数分裂染色单体结构[24]，参与同源染色体重组[25]。植物细胞中也起着同样的作用[26]。而RAD21L作用于同源染色体的配对、联会及重组[12-14, 27]。研究指出，含有RAD21L的两种不同粘连蛋白(RAD21L-SMC1α和RAD21L-SMC1β)在减数第一次分裂前期分担不同的作用[28]。使用基因敲除(Knock Out)小鼠的几项研究已报道减数分裂型粘连蛋白对同源染色体的重组至关重要。Rec8KO或Rad21lKO精母细胞在DSBs修复过程中出现严重缺陷，减数分裂停滞于前期[10,12]。甚至，Rad21LRec8dKO精母细胞显示，即使发生DSBs也几乎不修复，导致减数分裂停滞在细线期[15]。然而，目前尚不清楚两者在重组过程中的参与程度及其作用的分子机制。

本文通过结合免疫荧光染色法和3D-SIM技术分析减数分裂型α-kleisin亚基和重组中间体之间的关系，探究两者对同源染色体重组的贡献程度。通过3D-SIM观察发现在偶线期，横跨于部分同源染色体之间的RAD21L信号往往出现在MSH4和RAD51的临近之处[图1(h)和 (l)]，而REC8极少出现类似现象，大多存在于重组中间体的较远区域[图1(p)和(t)]。在粗线期，DSBs修复往往发展到在同源染色体之间形成SEI结构[9]。呈环状结构并包绕姐妹染色单体或非姐妹染色单体是粘连蛋白独有的结构特性，利用其环状结构可随意沿着染色体纵向滑移[图1(b)黑色箭头]。我们认为，REC8受到SEI结构的影响被动的滑移到重组中间体的边角之处[图1(p)和 (t)，图4(c)和(d)橙色箭头]。由此推测，在减数分裂型DSBs修复过程中RAD21L起主导作用，而REC8仅发挥协助作用。进一步的分析结果也证明了这一点。两种粘连蛋白与重组中间体的荧光信号的邻近程度具有很大的差距，邻近RAD51和MSH4的RAD21L荧光信号程度远高于REC8荧光信号(图2)。然而，由于在共免疫沉淀实验中未检测到粘连蛋白和重组中间体之间的相互作用，因此RAD21L与重组中间体直接作用的可能性不大。采用3D-SIM分析裂殖酵母减数分裂的研究表明，该生物种的唯一减数分裂型α-kleisin Rec8，在同源染色体的空间排列所必需的结构平台构建中起着至关重要的作用[29]。因此，减数分裂型粘连蛋白亚基在同源染色体之间建立联系的这一作用似乎在真核生物中均具有保守性。

(a)在细线期早期，RAD21L偶联非姐妹染色单体，REC8粘连姐妹染色单体；(b)在细线期晚期，RAD21L识别DSBs发生部位，并开始聚集其周围，REC8向DSBs部位的两侧移动；(c)在偶线期，RAD21L在DSBs周围建立结构平台(绿色箭头)，REC8受SEI结构的影响被动滑向SEI的边角之处(橙色箭头)；(d)在粗线期，RAD21L维持结构平台直到DSBs修复完成为止，REC8维持姐妹染色单体的粘连。图4 DSBs修复过程中RAD21L和REC8在染色体上的移动Figure 4 Movements of RAD21L and REC8 on chromosomes during DSBs repair

在脊椎动物的减数分裂中RAD21L和REC8的参与程度各有不同：在减数第一次分裂的前期，REC8的主要功能是粘连姐妹染色单体，次要功能是DSBs的修复，协助作用是联会复合体的装配。与之相比，RAD21L则在细线期的初期，偶联同源染色体的非姐妹染色单体，初步建立同源染色体之间的联系[图4(a)]；在细线期的晚期，主要识别DSBs的发生部位，并建立DSBs修复所需要的结构平台[图4(b)]；在偶线期，继续维持DSBs周边结构，协助MSH4等重组中间体完成DSBs的修复[图4(c)和 (d)]。该研究结果初步解释了RAD21L在同源染色体重组过程中作用的分子机制并提供了其作用机制模型。