舌尖上的毒素——河豚毒素

张钰聆，张立春

1四川大学分析测试中心，成都 610064

2四川大学化学学院，成都 610064

自古以来人类对于美食的探索就充满激情。

从人类能驾驭危险的火焰以来，就诞出了各种各样的美食，因此认为美食的探索也是可以促进人类的技术进步。从“第一个吃螃蟹的人”就能看出，人类对于吃的欲望能极大地促进社会的发展、技术的进步。不管危险与否，只要能食用，就会有人不顾危险。

人类在克服“吃”上面的危险时，无意间就解决了很多的问题。我们将通过对于河豚毒素的介绍，揭开人类对于“吃”的应用。

1 河豚文化

纵观我国的饮食文化史，河豚早就登台亮相，因其丰腴鲜美的口感受到无数人追捧，文人雅士在对河豚的描述中留下了精彩绝伦的诗词歌赋，美食和诗歌的相互交融，沉淀出独具特色的河豚文化。

“春洲生荻芽，春岸飞杨花。河豚当是时，贵不数鱼虾”，描述河豚最著名的诗词当属宋代诗人梅尧臣的《范饶州坐中客语食河豚鱼》，既体现了河豚在当时作为春季珍馐的珍贵，也反映了宋朝崇尚食用河豚风气的盛行；大文豪苏轼也对河豚肉格外钟情。“先生洗盏酌桂醑，冰盘荐此赪虬珠。似闻江鳐斫玉柱，更洗河豚烹腹腴”，苏轼在《四月十一日初食荔枝》中将河豚腹与当时物资稀缺时的荔枝相媲美，可见对河豚的狂热喜爱。虽早在4000多年前的《山海经·北海经》中就记载了大禹时代出现过食用河豚后中毒的现象，南宋词人舒岳祥也提及“美味河豚虐”，这些仍难以撼动河豚在我国美食史上举足轻重的地位。

口感的鲜美、时令的珍贵、毒素的危险，反而如美人“犹抱琵琶半遮面”，引得无数人无限遐想，对河豚情有独钟。日本也拥有历史悠久的“食鱼文化”，他们对河豚的喜爱可以说达到了痴迷的程度。文学家鲁迅先生当年在日本留学时，就品尝过其中的美味，“故乡黯黯锁玄云，遥夜迢迢隔上春。岁暮何堪再惆怅，且持卮酒食河豚”。在当时政局黑暗，故乡难归的时刻，借着河豚和酒进行自我劝慰，排解思乡之苦。

2 河豚毒素的结构解析

一方面河豚鲜美的滋味让人无法自拔，一方面食用河豚面临的危险又让人提心吊胆，食用河豚中毒的罪魁祸首正是来源于它的毒素——河豚毒素(tetrodotoxin，TTX)。

在科技日新月异的今天，化合物未知结构的解析可以借助一系列精密准确的光谱分析技术来实现，而在光谱数据欠缺的背景下，诸多研究者凭借对有机化学的精妙理解，在河豚毒素的结构解析上展现了令人惊叹的推理艺术。

河豚毒素的发现充满曲折，这与它独特的性质密不可分。河豚毒素易溶于水，而在有机溶剂中溶解性较差，通常情况下应用于生物碱的分离和提纯技术在获得TTX上完全失效。直到1950年日本化学家Yukoo才首次从河豚鱼的肝脏和卵巢中分离得到纯结晶态的TTX，后续拉开了TTX结构解析的序幕[1]。河豚毒素为氨基全氢喹唑啉型化合物，分子式为C11H17N3O8，呈弱碱性，为无色晶体，热稳定性良好，当时河豚毒素结构的光谱数据还很模糊，为了确定河豚毒素的结构式，Woodward[2]，Tsuda[3]和Goto[4,5]等课题组付出了巨大的努力。

最初对TTX结构的解析是从分析其降解产物入手(图1)[6]。为了分析其中N的存在形式，通过氧化降解得到胍2，从而排除结构中存在N-O键的可能，确定了完整的胍基结构单元。Woodward[2]通过乙酰化反应得到了4，并将其转化为铜螯合物5以证实结构。而通过强还原后分离得到了甲基喹唑啉6和8[2,3]，这表明喹唑啉可能是降解产物。后续发现在碱性和酸性介质中获得的产物3[3]和产物7[4]存在着羟基位置的差异，产物3后续通过其衍生物全合成[3]和氘代介质中的碱性降解[2]得以证明，虽然无法解释羟基位置存在的差异，但这些结果使得研究者们做出了大胆的推测：氢喹唑啉是TTX的结构核心。

图1 TTX降解示意图[6]

在对TTX核心结构的研究中，Goto[5]将注意力转向了衍生物，图2展示了TTX的衍生化研究，通过温和水处理得到衍生物9，在9与HIO4反应过程中，获得了产物10和副产物甲醛，这表明TTX中存在β-OH。而通过10获得了黄色针状喹唑啉衍生物12，产物7出现的原因也得以说明，即TTX的降解可能都是通过中间物10进行的。这些清楚地表明氢喹唑啉是河豚毒素结构核心。

图2 Goto对TTX衍生化研究[5,6]

在获得单晶[5,7]后，结合光谱表征数据，对河豚毒素的结构进行推导。根据产物9判断TTX为内酯结构，但由于其红外光谱中不存在内酯特征带(1690-2000 cm-1)，且TTX的弱碱性(pKa8.3)也与胍基存在并不相符，从而排除了TTX的内酯结构。Woodward[2]发现TTX (1658，1603 cm-1)处的红外吸收与代表质子化胍基(1656，1603 cm-1)的吸收相吻合，这为结构的推断提供了关键性的证据：TTX结构中含有质子化胍基，这决定了TTX必须是两性的，唯一的可能是将其中一个羟基添加到内酯官能团中以创建新的半内酯系统，对TTX的三维结构进行观察，发现C-5羟基正好位于与内酯部分相互作用的空间中，整个骨架的刚性是与半缩醛形式建立起平衡的重要因素。TTX在羟基内酯和半内酯结构间平衡转化(图3)[6]。

图3 TTX羟基内酯/半内酯结构平衡转化[6]

生物检测法最早被应用于河豚毒素及其类似物的研究，如小鼠生物实验(mouse bioassay,MBA)[8]、组织培养生物测定[9]、酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)[10]等，但生物测定法只能用于评估毒性，无法对单一毒素作用做出判断。20世纪70年代以后随着仪器分析发展，TTX的分析检测也得到了迅速的发展。色谱分离与不同检测技术联用成为分析河豚毒素的有力手段。质谱作为高灵敏度的检测器，在河豚毒素检测上得到良好应用，气相色谱-质谱联用仪(gas chromatography-mass spectrometer, GC-MS)成功用于河豚毒素的分析，但由于TTX的非挥发性，需要进行衍生化处理[11]；采用液相色谱避免了衍生化处理过程，在电喷雾电离(electrospray-ionisation，ESI)正离子模式下，河豚毒素及其类似物都可以得到质荷比(m/z)为320的离子，通过液相色谱-电喷雾质谱法 (liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry, LC-ESI-MS)可以得到良好的检测效果[12]。

3 河豚毒素的作用机制

TTX作为一种毒性极强的非蛋白质神经毒素，人体摄入后被肠道快速吸收，进入血液后经循环系统到达全身，引起呕吐腹泻、血压下降、脑神经功能障碍、四肢神经麻痹，丧失运动能力，更严重者会出现呼吸衰竭和心血管衰竭[13]。当TTX的化学结构被确定后，药理学以及毒理学专家对TTX表现出的独特生物活性产生浓厚兴趣，并逐渐揭开了TTX的中毒机制。

河豚毒素的生物学效应是由其与电压门控钠通道(voltage-gated sodium channel，VGSC)的相互作用介导的。VGSC是跨膜蛋白[14]，主要在肌肉和神经系统中表达，结构上由一个功能α-亚基和一个或多个参与电压传感的β-亚基组成，根据α-亚基的差异可以分为Nav1.1-Nav1.9和NavX等亚型，其中Nav1.1、Nav1.2、Nav1.3、Nav1.4、Nav1.6和Nav1.7对TTX敏感，其余对TTX抗性。VGSC在可兴奋细胞(例如神经元或肌细胞)表面表达，通过选择性允许钠离子的流入，在神经元信号的启动和传播中起作用(图4)。

图4 TTX在神经元细胞电压门控Na+通道中的作用机制[13]

通道的α-亚基决定了其与TTX作用的方式，当激活时，通道选择性地打开，钠离子进入细胞内环境。跨膜电位的局部变化导致相邻VGSC的打开，使得信号沿神经元传播，这构成了神经元和肌肉细胞中动作电位启动和传播的基础。当TTX与VGCS中相关位点结合时，阻止了钠离子的流入，神经元和相关肌肉将会无法运作，因此河豚毒素主要是阻遏神经和肌肉的传导，从而导致瘫痪。

4 河豚毒素在医疗上的应用

VGCS存在于整个神经系统和肌肉中，在执行许多基本生理功能中起到重要的作用，这使得TTX作为一种特异性钠离子通道阻滞剂有望成为万能的治疗药剂。当以远低于其LD50的水平给药时，TTX表现出特殊的治疗特性，目前已被证明在几种不同的疼痛模型中起到镇痛作用，包括神经性疼痛、胃肠道和内脏疼痛、癌症相关慢性疼痛等[15]。

钠离子通道在从伤害感受器到中枢神经的疼痛传导中占据着重要的作用，TTX展现出镇痛活性主要是基于其对特性钠离子通道的高度选择性阻断，通过抑制动作电位的启动和传导来阻断神经传递，因此在治疗神经性疼痛上具有广泛的应用前景。

神经性疼痛是由躯体感觉系统的疾病或损伤引起的，包括周围神经系统和中枢神经系统。在神经受损后，伤害感受神经元异常的自发放电造成了感受通路中的动作电位和放电频率异常，从而引起自发性疼痛。在啮齿类动物模型的研究中，TTX治疗神经性疼痛获得了良好的前景。在对小鼠热痛觉损伤的研究中，发现相比于其他阿片类药物使用时造成的成瘾、镇静和呼吸抑制等有害副作用，没有出现运动不协调、运动缺陷、呼吸窘迫等现象[16]，后续有望进一步在临床上得到验证。

此外，对TTX减轻癌症相关疼痛的能力进行了研究。随着癌症后期的发展，癌症本身、化疗等治疗方法以及相关并发症都会造成疼痛加剧。TTX作为镇痛剂已经在癌症患者身上得到具有临床意义的验证，虽然会有如口腔感觉消退和异常的轻微副作用[17]，但相比于阿片类易造成成瘾和具有遗传毒性的药物更适用于长期缓解疼痛。此外，TTX对抑制肿瘤细胞的转移和侵略体现出了一定的作用，在对结肠直肠癌细胞系的体外研究中发现TTX对两种癌细胞系都有着明显的抑制作用[18]，TTX具有的抗癌活性可用于开发潜在的抗肿瘤药物。

除了缓解疼痛，TTX还在治疗海洛因和可卡因戒断症状上显示出令人欣慰的效果。

海洛因戒断综合征和复发是成功治疗海洛因成瘾的主要问题。即使在长期戒断之后，与毒品相关的环境因素或暴露于压力源也会促使吸毒者在康复过程中复吸。因此，需要长期防止毒瘾复发。目前，阿片类药物常在受控的方式下治疗戒断症状，但阿片类药物的成瘾性使其不能长期使用。在2009年进行了一项涉及45人的双盲、安慰剂对照研究，发现单次肌肉注射10 μg TTX可显著降低暗示性海洛因成瘾者的焦虑和渴望，而对血压或心率没有显著影响[19]。但目前对TTX缓解戒断症状的机制尚不了解，其他潜在的副作用仍待进一步研究。

5 结语

河豚毒素在蝾螈、青蛙和一些海洋动物中都有发现，这些生物对自身体内的TTX具有天然的“免疫力”，其神经细胞的钠离子通道无法被TTX阻滞。

如吗啡、箭毒和肉毒杆菌毒素等神经毒素，由令人谈之色变的毒物摇身一变成为了药物市场甚至是化妆品市场的宠儿，TTX作为一种神经毒性药物，因其低分子量、高稳定性、非蛋白类等优点也具有巨大的潜在医药开发价值。当它以低剂量水平给药时，在缓解神经性疼痛、癌症相关疼痛等方面展现出治疗特性，对于毒品戒断、肿瘤治疗和脑损伤等疾病也有着潜在的治疗应用。虽然目前对于TTX的治疗机制的研究仍在起步阶段，其潜在的毒副作用也有待进一步说明，但河豚毒素的潜在应用显示出令人激动的成效，通过进一步研究测试TTX治疗动物模型以外的疾病的能力，确定这些治疗对患者的安全性和有效性，并优化给药效果，相信河豚毒素一定会在医疗治疗中获得显著的成效。