响应面法优化海金沙多糖提取工艺及其抗氧化活性

陈小燕，梁艳梅，陈旭波

（丽水学院生态学院，浙江 丽水 323000）

海金沙（Lygodium japonicum（Thunb.）Sw.）隶属于海金沙科海金沙属，别名铁线藤、左转藤。据《中国畲药植物图鉴·上卷》记载，该种植物在南方地区分布广泛，主要用于治疗尿路结石、肝肠炎、湿疹等，为地方标准收录的畲药。目前，海金沙主要应用于中药处方中，对其单味药效成分的研究也主要集中在黄酮、酚酸类和甾体苷类等化学成分方面[1-5]。据报道，海金沙主要成分具有抗菌消炎[6]、提高机体免疫力、抗肿瘤、降血糖[7]、抗氧化[8]、消除自由基[9]及其他的临床治疗功效[10]。然而，目前对海金沙有效成分之一的多糖的研究却相对较少[11]。

植物多糖提取的常见方法有热水浸提法[12]、复合酶解法[13]、微波法[14]和超声波法[15]等。微波提取技术与传统的提取方法相比较，具有低成本、高效率等优点，更加适合快速提取植物多糖[16]。孙萍等[17]运用微波技术提取甘草多糖发现：通过微波处理提取不仅能够有效减短试验周期，实验中溶剂的消耗量也得到减少，而且多糖的提取率也由传统方法的9.82%提高到13.90%，较传统方法提高了41.5%。实验表明，利用微波技术更有利于提取多糖。响应面分析法是目前采用较多的优化方法之一，不仅能够分析单个因素对提取的影响，还能分析各因素之间的交互作用。它将体系的响应值作为一个或多个因素的函数，运用图形技术显现各拟合因素和响应值之间的关系，并且通过计算可推断出一个较为合理的预测值。

因此，笔者将以海金沙为实验材料，采取微波传统提取法和微波辐射预处理法提取海金沙多糖，利用浓硫酸-苯酚法，计算多糖的提取率。以多糖提取率作为考察指标，在单因素实验的基础上通过响应面优化提取工艺。参考姚秋萍等[18]的研究测定海金沙多糖粗提物对超氧阴离子自由基的清除率，以评价海金沙多糖的抗氧化能力，为后续研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 海金沙的采集

海金沙干粉：海金沙植株于2020年采自丽水学院校园，阴干，打粉，过40目筛，备用。

1.2 仪器与试剂

电子天平（北京塞多利斯天平有限公司，ISO9001）；电热恒温水浴锅（上海博迅实业有限公司医疗设备厂，HHS）；台式高速离心机（SIGMA Laborzentrifugen GmbH，3K15）；G8023DH L-V8型微波炉（佛山市顺德区格兰仕微波炉电器有限公司）等。

95%乙醇、葡萄糖溶液、5%苯酚、浓硫酸、10 mmol/L邻苯三酚、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl）等。

1.3 数据统计方式

采用Design-Expert 11.0软件进行多元回归拟合；利用Spss 16.0进行方差分析；利用Excel 2010作图。

1.4 海金沙多糖提取条件的优化

微波传统提取见前人的研究[16]，传统提取因素包含了微波时间、微波功率、液料比。在80℃热水浴中提取60 min，抽滤除渣，获得海金沙多糖提取液。利用旋转蒸发仪将提取液浓缩到一定体积，然后加入4倍体积的95%乙醇，静置过夜。次日在4 000 r/min条件下离心5 min，收集沉淀物并重复醇沉一次，即得水提粗多糖。测定多糖提取率，以确定最佳提取工艺。

微波辐射预处理参考王赵改等[19]的方法，通过控制微波时间、微波功率、液料比和汽化剂用量等因素对样品进行辐射预处理。在80℃热水浴中提取60 min，抽滤除渣得海金沙多糖提取液。利用旋转蒸发仪将提取液浓缩至一定体积，然后加入4倍体积的95%乙醇，静置过夜。次日在4 000 r/min条件下进行离心5 min，收集沉淀物并重复醇沉一次，即得水提粗多糖。测定多糖提取率，以确定最佳提取工艺。

1.5 海金沙多糖提取率的测定

采用浓硫酸-苯酚法[20]对海金沙多糖提取率进行测定。葡萄糖标准曲线的绘制：分别依次精确吸取100 μg/mL的葡萄糖标准溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于试管中，加入适量蒸馏水定容到1 mL。加入5%的苯酚溶液1 mL，摇匀，在冰浴条件下沿试管壁缓慢加入5 mL浓硫酸，充分摇匀后沸水浴15 min，取出后迅速冷却至室温，以蒸馏水为空白对照组，在490 nm波长下测其吸光值。以葡萄糖浓度作为横坐标，吸光值作为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程。

海金沙多糖提取率的测定：将提取的海金沙多糖定容到一定体积，精确吸取1 mL溶液于试管中，依次加入1 mL 5%的苯酚溶液和5 mL浓硫酸，摇匀，沸水浴15 min。取出后迅速冷却至室温，于490 nm处测其吸光值，根据葡萄糖标准曲线计算多糖提取率（%），计算公式如下：式中：C为测得的多糖溶液浓度，μg/mL；V为多糖溶液定容体积，mL；N为样品稀释倍数；M为样品质量，mg。

1.6 海金沙多糖提取的单因素实验与响应面实验设计

1.6.1 微波传统提取法

以海金沙干粉为实验材料，以多糖提取率作为考察指标。在单因素实验的基础上进行响应面实验设计。以测得的多糖提取率当作响应值，进行设计，详见表1。

表1 单因素实验设计和响应面水平编码

1.6.2 微波辐射预处理法

以海金沙干粉为实验材料，以多糖提取率作为考察目标。在单因素实验的基础上进行响应面实验水平设计，以测得的多糖提取率为响应值，进行四因素三水平设计，单因素实验及响应面实验设计如表2所示。

表2 单因素实验设计及响应面水平编码

1.7 海金沙多糖抗氧化活性测定

取不同浓度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）的海金沙多糖溶液0.2 mL，加入50 mmol/L的Tris-Hcl缓冲液（pH=8.2）5.7 mL，在25℃热水浴条件下保温10 min，然后加入于25℃预热的邻苯三酚溶液（6 mmol/L）0.1 mL。迅速摇匀，以多糖溶液为空白组在320 nm处测定反应1 min时的吸光值（A2），每组分别设置3份平行。以等量的蒸馏水代替海金沙多糖溶液，将Tris-Hcl缓冲液调零，在相同波长下获得1 min时的吸光值（A1），每组分别设置3份平行。

对照试验选用不同浓度Vc（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）代替多糖溶液，其余操作步骤、试剂及条件不变，测定吸光度，每组设3份平行。自由基清除率计算公式如下：

2 结果与分析

2.1 葡萄糖标准曲线的绘制

以100 μg/mL葡萄糖标准溶液作为对照品，绘制葡萄糖标准曲线。葡萄糖标准曲线方程为y=0.007 8x-0.023 5，R2=0.996 1，如图1所示具有较好的相关性。

图1 葡萄糖标准曲线

2.2 海金沙多糖提取的单因素实验

2.2.1 微波传统提取法

由图2可知，海金沙多糖提取的最适微波功率为280 W，最大值为4.784%；功率在350～420 W范围内时，较强的微波功率可能导致海金沙多糖的有效成分被分解或被破坏，导致最终多糖提取率反而随着微波功率的逐渐增大而减小。由图3可知：在微波时间为0～120 s内，提取率出现先上升后下降现象，提取率在60 s时为7.619%。由图4可知：液料比的大小对提取率有着明显的影响，20（mL/g）时提取率最大，为8.894%，在到达峰值后随着液料比的增大多糖提取率并无明显的变化，而是趋于平缓。

图2 多糖提取率对微波功率的响应

图3 多糖提取率对微波时间的响应

图4 多糖提取率对液料比的响应

2.2.2 微波辐射预处理提取法

由图5可知：在280 W时多糖提取率达到最大，此时提取率为4.601%。由图6可知：当液料比为20（mL/g）时，多糖提取率达到最高值，为8.24%。由图7可知：当使用微波处理60 s时，海金沙多糖的提取率最高，为10.14%。由图8可知：汽化剂在0～7.5 mL之间，海金沙多糖提取率随着用量的增加而逐渐上升，7.5 mL时多糖的提取率最大，为15.642%。

图5 多糖提取率对微波功率的响应

图6 多糖提取率对液料比的响应

图7 多糖提取率对微波时间的响应

图8 多糖提取率对汽化剂用量的响应

2.3 响应曲面结果与分析

2.3.1 微波传统提取法的多糖提取率二次响应面回归模型的建立与分析

对表3中17组数据进行多元回归拟合分析得到如下方程：

对表3中17组数据进行回归模型方差分析得到表4。由表4可知：回归模型差异极其显著（P＜0.000 1），失拟项差异不显著（P=0.087 6＞0.05），这说明该回归方程具有良好的拟合性，试验误差值较小说明模型的精确度和准确度很高，重现性很好。一次项C，二次项A2、B2、C2对海金沙多糖提取率均达到极显著水平（P＜0.01）。由F值可知各因素影响从大到小的顺序为：液料比＞微波功率＞微波时间。因素之间的相互作用见图9～11。

图9 功率与时间的3D响应面图

表3 响应面实验设计与结果

表4 回归模型方差分析

图10 液料比与功率的3D响应面图

图11 液料比与时间的3D响应面图

2.3.2 微波传统提取法的海金沙多糖提取工艺的确定与验证

根据回归模型及软件分析得出微波传统提取海金沙多糖的最优工艺参数为微波功率279.658 6W、微波时间57.007 3 s、液料比23.861（mL/g）。考虑可行性及实验操作的便利性，将最佳工艺参数修正为微波功率280 W、微波时间57 s、液料比24（mL/g），该条件下多糖提取率的预测值为7.756%。通过验证试验表明：多糖的提取率为7.582±0.156%，实际值与预测值没有显著性差异。

2.3.3 微波辐射预处理提取的海金沙多糖提取率二次响应面回归模型的建立与分析

对表5中29组数据进行多元回归拟合分析得到如下方程：

表5 响应面实验设计与结果

对29组数据进行回归模型方差分析得到表6。由表6可知：回归模型差异极其显著（P＜0.000 1），失拟项差异不显著（P=0.159 0＞0.05），这说明该回归方程对试验具有良好的拟合性，试验误差较小为4.46%，说明模型精确度和可信度较高。一次项A和C，二次项AB、AC、BC、BD对海金沙多糖提取率均达到极显著水平（P＜0.01）。由F值可知各因素影响从大到小的顺序为液料比＞微波功率＞微波时间＞汽化剂用量。因素间的相互作用见图12～17。

图12 功率与时间的3D响应面图

表6 回归模型方差分析

图14 汽化剂用量与功率的3D响应面图

图16 液料比与时间的3D响应面图

2.3.4 微波辐射预处理提取工艺的确定与验证

根据回归模型及软件分析得出微波辅助预处理海金沙多糖的最优工艺条件为微波功率338.54 W、微波时间71.25 s、液料比28.00（mL/g）、汽化剂用量4.967 mL。考虑实验的可行性及操作的便利性，将最佳工艺参数修正为微波功率350 W、微波时间71 s、液料比28（mL/g）、汽化剂用量5 mL。该条件下多糖提取率的预测值为13.881%。验证实验表明：多糖的提取率为13.507±0.177%，实际值与预测值没有显著性差异。

图13 液料比与功率的3D响应面图

图15 汽化剂用量与时间的3D响应面图

图17 液料比与汽化剂用量的3D响应面图

2.4 海金沙粗多糖的抗氧化活性测定

研究表明：通过测定O2-的清除率能反映出物质抗氧化性强弱[21]。本实验以Vc和两种提取方法提取的海金沙粗多糖为对象，测定不同样品对O2-的清除作用。实验表明：多糖的质量浓度越高其相应抗氧化能力也就越强。如图18，样品质量浓度在0.2～0.6 mg/mL范围内，O2-清除率的上升幅度较大；当质量浓度大于0.6 mg/mL时，O2-清除率上升趋势逐渐平缓。从总体上来看，在相同质量浓度条件下，Vc清除O2-的能力明显高于海金沙多糖，但两种方法提取的海金沙多糖在1 mg/mL条件下对O2-清除率均可以达到60%以上。

图18 抗氧化活性

3 讨论与结论

植物多糖提取方法一直是研究的热点。不同来源的植物多糖具有不同的特征与性质，因此在对植物多糖进行研究时，应针对植物材料的特征和性质，选用适宜的提取方法[22]，在尽可能提高多糖提取率的基础上，保证多糖活性。

微波辐射预处理法是先使用一定量的汽化剂先对干物料进行适当时间的浸润，然后再用高频电磁波波能对细胞结构进行破坏，最后用热水提取法进行多糖萃取的一种预处理方法，有别于传统微波提取。实验结果表明：当微波功率及处理时间超过一定限度时，多糖提取率不会继续增加，反而会下降。这可能是因为微波的过度处理，使有效成分遭到破坏。蔡锦源等[23]利用微波辅助预处理法提取香菇多糖并与热水浸提法相对比，表明两种工艺提取多糖的提取率不同，抗氧化活性也不同，微波辅助预处理法提取香菇多糖不仅提取率更高，抗氧化活性也更强。笔者采用的两种微波处理方式表明，其多糖抗氧化活性并没有显著性差异。

结果表明：微波辐射预处理提取的多糖的提取率（13.509%）显著高于微波传统提取（7.756%）。对其粗提物进行初步纯化后测其抗氧化活性发现，两者抗氧化活性虽均低于Vc，但在1 mg/mL浓度时对O2-清除率均可以达到60%以上，证实海金沙多糖具有较好的抗氧化性。本研究得到的多糖提取率略高于肖怀秋和李玉珍的研究（提取率为12.85%）[24]，而提取时间仅为其一半，可见微波辐射预处理的优势。另外本研究的提取率低于武芸等人的研究（提取率为16.475%）[25]，这与提取次数及提取时间的不同有关。

可见，微波辐射预处理在提取海金沙多糖方面较微波传统提取具有一定的优势，提取率高且抗氧化活性不会改变。该方法是否适用于其他植物材料有待于进一步验证。