春小麦主要籽粒性状的全基因组关联分析

严勇亮，张 恒，张金波，时晓磊，耿洪伟，肖 菁，路子峰，倪中福，丛 花

(1. 中国农业大学农学院，北京 100193；2. 新疆农业科学院农作物品种资源研究所，新疆乌鲁木齐 830091;3. 新疆农业科学院国际科技合作交流处，新疆乌鲁木齐 830091；4. 新疆农业大学农学院/农业生物技术重点实验室，新疆乌鲁木齐 830052)

小麦是中国主要粮食作物之一，其产量高低直接关系国家粮食安全。培育高产小麦新品种是提高产量最直接有效的方法，而小麦种质资源的遗传分析对小麦遗传改良具有重要作用。小麦籽粒性状与产量关系密切，对小麦最终产量形成有重要作用。在育种工作中通常通过改良籽粒性状来提高小麦产量，但传统育种方法盲目性大、效率较低，导致品种同质化严重，分子标记辅助选择(marker-assisted selection，MAS)技术的发展，有助于提高选择效率和可预测性，进而加速育种进程。

小麦的千粒重、粒长、粒宽等籽粒性状是由多基因控制的数量性状，受基因和环境共同调控，QTL定位和全基因组关联分析(genome wide association study，GWAS)是研究数量性状的主要方法。GWAS是以连锁不平衡为基础，在全基因组水平上对自然群体目标性状的遗传变异与基因多样性进行关联，筛选出与表型变异相关的分子标记的一种方法，也被称为连锁不平衡作图。传统的QTL定位精度较低，只能将目标QTL定位在5～20 cM的基因组区间内，相较于双亲连锁分析，GWAS考虑了更加复杂的遗传背景，在解析小麦数量性状遗传基础方面的应用越来越广泛。前人以不同来源的小麦品种(系)为材料，利用小麦SNP和SSR标记并结合GWAS，在除1A、1D、3D、4D和6A之外的16条小麦染色体上发现了大量与千粒重显著关联的位点，表型贡献率为6.7%～ 13.0%；在除6B之外的20条染色体上发现了大量与小麦粒长显著关联的位点，其表型贡献率为2.40%～ 53.84%；在除1B、1D、2D、6D和7B之外的16条染色体上发现了大量与小麦粒宽显著关联的位点，其表型贡献率为2.80%～47.12%。

SNP标记在基因组中具有分布广、数量多以及定位精度高等特点，被广泛应用于育种工作中。新疆作为中国小麦主产区之一，小麦产量的提升至关重要。但常规育种手段跟不上生产需求，需对分子标记等新技术进行充分使用，但基于高密度芯片技术对新疆小麦籽粒性状的GWAS鲜有报道。因此，本研究以298份新疆种植的春小麦品种为材料，利用55K SNP基因芯片对5个环境下的千粒重、粒长、粒宽3个主要籽粒性状进行GWAS分析，以期获得新的控制小麦籽粒性状的遗传位点，并挖掘相关的候选基因，为精细定位、基因克隆和分子标记辅助选择提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试验设计

以298份新疆种植的春小麦品种为材料，其中国外引进品种110份、新疆地方品种141份、新疆育成品种47份，该群体在一定程度上反映了不同时期适合新疆地区种植的小麦种质特性。于2018、2019、2020连续3年将供试材料种植于新疆乌鲁木齐市新疆农业科学院安宁渠基地，分别简称为E1、E2、E4；于2019、2020连续2年将供试材料也种植于新疆喀什市新疆农业科学院泽普小麦育种家基地，分别简称为E3和E5。采用随机区组设计，每份材料种植3行，行长2 m，行距20 cm，3次重复，人工播种。在试验田四周设置保护行，大田管理同当地农田基本栽培管理措施。

1.2 测定项目与方法

1.3 SNP分型与全基因组关联分析(GWAS)

本课题前期利用小麦基因组55K SNP芯片对供试材料进行基因分型，并进行了群体结构分析和连锁不平衡分析。本研究利用TASSEL 5.0软件中的Q+K混合线性模型MLM对298份小麦品种在5个不同环境下的3个籽粒性状进行GWAS，以=0.001为阈值，判定SNP标记与目标性状关联的显著性。以LD衰减距离(8 Mb)作为候选基因的预测区间，将多个环境中稳定出现的SNP标记的延伸序列在小麦TGAC v1.0数据库(http://plants.ensembl.org/hmmer/index.html)和NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行BLASTX，对候选位点进行功能注释。

2 结果与分析

2.1 籽粒性状表型统计分析结果

从表1可以看出，国外引进品种、新疆地方品种和新疆育成品种的3个主要籽粒性状(千粒重、粒长、粒宽)有一定的差异，三种类型小麦在5个环境下的变异系数分别为4.95%～19.77%、 5.04%～17.39%和3.89%～17.41%，其中粒宽的变异幅度最小，千粒重的变异幅度最大。不同环境中，新疆育成品种的3个籽粒性状的平均值均高于国外引进品种和新疆地方品种，新疆地方品种的3个籽粒性状的平均值均最低。方差分析结果表明，基因型、环境以及基因型与环境互作对于春小麦籽粒性状均有极显著影响，千粒重、粒长和粒宽的遗传力分别为0.92、0.94和 0.87，说明3个籽粒性状受遗传因素的影响较大。

2.2 全基因组关联分析(GWAS)结果

利用TASSEL 5.0软件中的Q+K混合线性模型MLM，并结合55 K基因芯片的23 632个SNP标记，对298份小麦品种在5个环境下的3个籽粒性状进行GWAS，结果共定位到84个同时在2个及2个以上环境中显著关联的稳定SNP标记，它们分布在小麦21条染色体上，可解释3.74%～11.18%的表型变异。检测到23个与千粒重显著关联的标记，它们分布在除2A、4D、5D、6D和7B之外的16条染色体上，可解释3.85%～9.25%的表型变异，其中在5B染色体上检测到3个与千粒重显著关联的标记。检测到54个与粒长显著关联的标记，它们分布在除4B和7B之外的19条染色体上，可解释3.74%～11.18%的表型变异，其中在1B染色体上检测到7个与粒长显著关联的标记，在4A、5B、5D和7D染色体上检测到4个与粒长显著关联的标记，在1A、2B、3D、5A和6D染色体上检测到3个与粒长显著关联的标记，说明这些染色体对粒长影响较大，尤其是1B染色体，可作为研究粒长性状重要的染色体，另外位于1B染色体上的AX-110525847、1D染色体上的AX-94745216、3B染色体上的AX-111464452、7A染色体上的AX-108802871和AX-111664463在所有环境下均被检测到，可作为后续研究粒长性状的重要标记。检测到7个与粒宽显著关联的标记，它们分布在1B、2B、4B、5B、5D、6B和7B染色体上，可解释 3.79%～7.74%的表型变异(图1和表2)。

表1 春小麦籽粒性状表型变异Table 1 Grain phenotypic variation in spring wheat

图1 春小麦籽粒性状Q-Q图和曼哈顿图

续图1 春小麦籽粒性状Q-Q图和曼哈顿图

在1B染色体637.98～643.18 Mb的区间检测到与千粒重、粒长和粒宽显著关联的标记位点；在2B染色体11.30～11.90 Mb的区间检测到与粒长和粒宽显著关联的标记位点；在3B染色体720.17～725.28 Mb的区间检测到与千粒重和粒长显著关联的标记位点；在4B染色体596.35 Mb处检测到同时与千粒重和粒宽显著关联的标记位点；在5A染色体511.90～518.31 Mb的区间检测到与千粒重和粒长显著关联的标记位点；在5D染色体384.77～390.26 Mb的区间检测到与粒长和粒宽显著关联的位点标记(表2)。这说明B染色体组在小麦籽粒形成过程中发挥着重要的调控作用，这些染色体区段可作为后续研究的重点内容。

表2 与春小麦籽粒性状显著关联的SNP标记Table 2 SNP marker significantly associated with grain traits in spring wheat

(续表2 Continued table 2)

2.3 小麦籽粒性状候选基因的功能预测

将与小麦籽粒性状稳定关联的SNP标记的延伸序列在中国春基因组数据库中进行搜索，获取基因序列，并在NCBI数据库中进行BLASTx，共获得6个与籽粒性状相关的候选基因(表3)，它们分别编码含NB-ARC域的抗性蛋白、胚芽蛋白样蛋白、RING/U-box超家族蛋白、晚期胚胎发生丰富蛋白、O-甲基转移酶和含有LRR和NB -ARC域的抗病蛋白。

表3 筛选到的与小麦籽粒性状相关的候选基因Table 3 Candidate genes screened potentially related to wheat grain traits

3 讨 论

3.1 春小麦籽粒性状的表型变异

小麦是中国主要粮食作物之一，小麦籽粒相关性状的遗传解析对提高中国小麦产量具有重要意义。本研究通过对298份春小麦品种在5个环境下籽粒性状(千粒重、粒长和粒宽)的表型变异进行分析，发现不同环境下，新疆育成品种的3个籽粒性状的平均值均高于国外引进品种和新疆地方品种；新疆地方品种的3个籽粒性状的平均值最低。马艳明等研究也表明，新疆冬小麦育成品种的千粒重、粒长和粒宽普遍高于地方品种。其原因可能是当地小麦地方品种的产量潜力有限，导致小麦籽粒的大小和千粒重成为新疆育种家关注的重要性状。本研究还发现，新疆春小麦品种籽粒性状变异较大，遗传背景丰富，且遗传力较大，比较容易挖掘出调控小麦籽粒性状的优异候选基因，从而对现有的春小麦品种进行遗传改良，进一步提高新疆小麦的产量。

3.2 春小麦籽粒性状的全基因组关联分析(GWAS)

小麦籽粒性状是受多基因控制的数量性状，GWAS是研究与目标性状相关的分子标记、挖掘相关功能基因常用的方法之一。本研究在1A染色体11.57～30.14 Mb的区间内发现3个与小麦粒长显著关联的标记，Li等也在这一区间发现了与小麦籽宽显著关联的标记，说明这一区间可能存在调控小麦籽粒形成的重要基因。翟俊鹏等在1B染色体652.58 Mb处发现的与抽穗期显著关联的标记与本研究在637.98～643.18 Mb区间发现的与千粒重、粒长和粒宽显著关联的标记距离9.40～14.60 Mb，虽然距离超出LD衰减距离，但是距离较近，推测这两个位点可能为同一位点，此位点可能为新发现的控制小麦籽粒性状的稳定的一因多效位点；本研究在5B染色体18.52 Mb处发现的与粒长显著关联的标记与翟俊鹏等发现的与穗粒数显著关联的标记距离为8.08 Mb，Sun等也在5B染色体 10.88处发现了与粒长关联的标记，根据本研究衰减距离为8 Mb，可将这几个标记位点看作为同一位点。这些不同研究中得到的相同或相近位点，具有较高的可靠性，可以为辅助育种的分子标记开发提供参考，同时对于进一步发掘候选基因具有重要价值。

本研究在1A染色体468.73～488.65 Mb的区间检测到与千粒重显著关联的标记，与Li等发现的标记在染色体上的距离为28.53～34.63 Mb，说明这两个标记位点不是同一位点；与张 芳等在1A染色体473.7 Mb处发现的调控小麦粒长和籽粒周长的标记距离仅为4.97 Mb，可能为同一位点。本研究在1A染色体 535.43～ 536.44 Mb的区间也检测到与千粒重显著关联的标记，与翟俊鹏等在1A染色体519.47 Mb处发现的与株高显著关联的标记距离为 15.96～16.97 Mb，这与本研究发现的标记位点不是同一位点，推测本研究发现的标记位点为新位点。本研究在3B染色体720.17～725.28 Mb的区间检测到与粒长和千粒重显著关联的标记，在4B染色体596.35 Mb处检测到同时与粒宽和千粒重显著关联的标记，但这些标记位点均未见报道，推测这些标记位点可能是控制小麦籽粒性状的新位点。这些新发现的SNP标记位点为解析小麦籽粒性状的遗传基础提供了新的研究方向，同时为进一步挖掘调控小麦籽粒性状的基因奠定了基础，但还需要进一步验证这些标记位点的稳定性、可靠性和多效性。

3.3 候选基因分析

将与小麦籽粒性状显著关联的稳定SNP标记序列在NCBI数据库中进行BLASTx，共得到6个与小麦籽粒性状相关的候选基因。其中，位于3B染色体上的TraesCS3B01G473700编码RING/U-box超家族蛋白，该家族蛋白在泛素通路中起作用，可调节种子和器官大小。位于4B染色体上的TraesCS4B01G332700编码晚期胚胎发生丰富蛋白，该蛋白在籽粒干燥耐受性中起重要作用，推测其通过调控籽粒干燥过程中的耐受性来影响籽粒的最终形成。位于6A染色体上的TraesCS6A01G389900编码O-甲基转移酶，该酶在细胞间起黏附作用，推测其通过调控籽粒内细胞间的黏附程度影响籽粒的重量、大小、形状等性状的形成。

4 结 论

本研究通过对298份春小麦品种3年共5个环境的3个主要籽粒性状结合55 K SNP基因芯片进行GWAS，共得到84个显著关联的稳定SNP标记，并在1A染色体上检测到2个与小麦千粒重显著关联的新标记位点，在1B染色体上检测到1个与小麦千粒重、粒长和粒宽显著的新标记位点，在3B染色体上检测到1个与小麦粒长和千粒重显著的新标记位点，在4B染色体上检测到1个与小麦粒宽和千粒重相关的新标记位点。经筛选获得6个可能调控小麦籽粒性状的候选基因，这些候选基因可能通过调控小麦机体生理活动、有机物合成、蛋白活性等影响小麦籽粒性状的最终形成。

致谢：本研究在试验进行和论文撰写过程得到西北农林科技大学许盛宝教授的大力支持，特此致谢！