55株鸡大肠杆菌超广谱β-内酰胺基因的检测分析

李文超

（方正县农业农村局，黑龙江 方正 150800）

超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)迅速蔓延全球，目前已超出500个变种，频繁出现在人类和动物临床肠杆菌科分离株中。ESBLs菌株的典型特征是能水解羟亚氨基-头孢菌素类，对β内酰胺抑制剂敏感的ESBLs，尤其是TEM，SHV和CTX-M酶表现高度多样性。因此，本研究主要针对TEM，SHV和CTX-M这三种耐药基因进行检测，以了解黑龙江地区流行的基因型和分子特征。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 从黑龙江省15个不同鸡场，以无菌器皿操作采集55只疑似大肠杆菌病病死鸡肝脏样品，并且均来源于刚刚病死鸡。通过分离培养得到55株病原菌。经PCR扩增测序，BLAST比对，结果显示全部为大肠杆菌。

1.1.2 药物及培养基Mueller-Hinton Broth(MH)琼脂粉、培养基购自杭州天和微生物试剂有限公司；头孢噻肟、头孢他啶、头孢曲松和氨曲南药敏片购自杭州天和微生物试剂有限公司；头孢噻肟、头孢他啶、头孢吡肟和庆大霉素抗生素干粉购自哈药集团制药总厂；质粒提取试剂盒（TaKaRa Mini BEST Plasmid Purification kit）购自QIAGEN公司；核酸分子量标准品购自TIANGEN生化科技有限公司；Ex Taq DNA聚合酶、dNTPs购自TaKaRa公司；DNA凝胶回收、纯化试剂盒购自长春百奥生物技术有限公司；琼脂糖购自Spanish公司；溴化乙锭（EB）购自北京爱普华美生物技术有限责任公司。

1.2 方法

1.2.1 产ESBL菌株的鉴定 根据CLSI(CLSI，2012)推荐使用的ESBLs初筛实验方法进行，MH琼脂培养基接种待测大肠杆菌，选用头孢噻肟、头孢他啶、头孢曲松和氨曲南按照标准纸片扩散法进行操作，记录各纸片抑菌环直径与标准对比进行初筛（见表1）。

表1 初筛ESBL表型解释标准

只要其中有一种或一种以上抗生素纸片抑菌直径符合上述标准可视为ESBLs可疑株。将可疑菌株按0.5麦氏浊度再次涂布MH平板上，按照标准纸片扩散法进行操作，选用头孢他啶、头孢他啶／克拉维酸、头孢噻肟、头孢噻肟／克拉维酸进行ESBL表型确证实验（见表2）。

表2 确证ESBL表型解释标准

1.2.2 ESBLs耐药基因的扩增 由于大多数的ESBL基因被证实是定位在质粒上，使用质粒提取试剂盒（TaKaRa Mini BEST Plasmid Purification kit）提取确认为ESBLs的大肠杆菌的质粒并纯化，然后PCR扩增blaTEM，blaSHV和blaCTX-M，引物由invitrogen公司合成（见表3）。

表3 本实验使用的引物

反应条件分别为：

SHV和TEM；94℃预变性3min；94℃变性30s、48℃退火30s、72℃延伸1min，共30个循环；72℃再延伸10min。

CTX-M：94℃预变性7min；94℃变性50s、50℃退火40s、68℃延伸1min，共35个循环；68℃再延伸5min。

将PCR扩增产物进行1.0%(w/v)琼脂糖凝胶电泳检测，EB染色（0.5μg/mL），观察结果。

对PCR产物进行纯化，然后连接至T载体(Promega)，测序。通过BLAST进行网上序列分析。

2 结果

2.1 产ESBL大肠杆菌的鉴定 经鉴定，确认55个分离株中有46株大肠杆菌呈ESBLs表型。

2.2 ESBLs耐药基因的扩增 经测序，比对分析，在46株呈ESBLs表型的大肠杆菌中，37株携带至少一种bla基因。26株携带TEM-1基因；32个分离株携带CTX-M基因，其中16株携带CTX-M-15，10株携带CTX-M-55，6株携带CTX-M-3基因（见图1）。没有分离到携带blaSHV基因的大肠杆菌。

图1 病鸡大肠杆菌CTX-M和TEM基因的检测（部分结果）a泳道1-4：CTX-M；b泳道5-7：TEM

3 讨论

随着家禽的β-内酰胺类抗生素如阿莫西林和头孢菌素类，尤其是超广谱头孢菌素类的广泛使用，在革兰氏阴性杆菌由ESBL介导的耐药性越来越危险，这类感染的治疗选择变得受限。为了了解ESBL在动物相关细菌中的流行，限制这些MDR生物在兽医环境中的传播，对产ESBL细菌进行检测很重要。在本研究中，83.64 %(46/55)的分离株为产ESBLs大肠杆菌。46个ESBL表型阳性的大肠杆菌中有37株(80.43%)携带bla基因。在这37个分离株中，检测到32株(69.57%)携带bla CTX-M，26株(56.52 %)携带blaTEM基因。37个分离株中有21株菌同时携带2种bla基因(blaTEM和blaCTX-M)。没有分离到携带blaSHV基因的菌株。这些研究结果表明，在鸡大肠杆菌分离株中，blaTEM和blaCTX-M基因为两种主要的ESBL类型，CTX-M型的β-内酰胺酶正在中国抗生素耐药中发挥越来越重要的作用。此外，这些研究结果还表明TEM-1是在中国鸡大肠杆菌中最常见的β-内酰胺酶。

研究还表明，在46个产ESBL的大肠杆菌分离株中，blaCTX-M基因编码CTX-M-15、CTX-M-55和CTX-M-3的检出率分别为34.78%、21.74%和13.04%，表明在不同CTX-M-型β-内酰胺酶广泛地分布于黑龙江的鸡大肠杆菌分离株。