自噬在脂多糖诱导的A549细胞炎症反应中的作用及机制研究

时佳 陶慧娴 郭艳 邹芸苏 王木子 卢志涛 丁溢芳 许卫东 周晓光

（1.南京医科大学附属儿童医院新生儿医疗中心，江苏南京 210008；2.张家港市第一人民医院新生儿科，江苏张家港 215600）

急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是机体在遭受各种病理刺激（如缺氧、感染、休克等）后发生的一种急性肺损伤（acute lung injury，ALI），是新生儿临床常见的危重症。其特征是肺泡-毛细血管膜屏障遭到破坏，从而增强炎症细胞的迁移能力和促炎细胞因子的产生，使炎症反应失控［1］。迄今为止，ARDS的发病率和病死率一直居高不下。因此，迫切需要阐明新生儿ARDS的发病机制以制订相应的防治措施。

自噬是一种古老的、进化保守的细胞内消化和再循环途径，主要包括巨自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬3种类型，对于维持细胞的正常功能及细胞稳态具有重要作用。巨自噬以其处理大型细胞内结构的能力著称，双膜囊泡结构的自噬体也成为其区别于另外两种自噬形式的特征。自噬参与人类多种疾病的发生、发展过程，本研究主要对巨自噬（以下简称“自噬”）进行研究。自噬被认为是应对炎症的一种基本细胞反应，其相关途径（如微管相关蛋白轻链3相关吞噬作用和非常规分泌等）是免疫和炎症的核心稳态机制［2］。一般来说，自噬有助于宿主激活免疫以控制感染，同时限制有害的、不受控制的炎症反应。在先天免疫系统中，Toll 样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4） 是一种重要的模式识别受体（pattern recognition receptor，PRR），PRR 通过识别病原体相关分子模式或危险相关分子模式，调节先天免疫或炎症过程［3］。TLR4 也是第1 个被证明参与自噬 过 程 的 受 体［4］。 TLR4 经 脂 多 糖（lipopolysaccharide，LPS）激活后产生的细胞因子参与病原体的清除，对机体有益；但当该过程失调时，可能会导致危及生命的病理生理改变，如新生儿ARDS［5］。因此，TLR4 被认为是一个重要的药理学靶点。目前有关自噬与新生儿ARDS发病关系的研究报道极少，自噬在新生儿ARDS炎症反应所致肺损伤中的作用与机制尚不明了。本实验利用LPS 诱导人肺泡上皮A549 细胞（简称“A549细胞”）炎症反应来模拟新生儿ARDS发病过程中失控的炎症反应与肺损伤变化，旨在探讨自噬在炎症反应导致肺损伤过程中的作用及其机制，为新生儿ARDS的防治提供新的途径和实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞和主要试剂

人肺泡上皮细胞株A549（上海中乔新舟生物科技有限公司）；DMEM 高糖培养基（Gibco，美国）；磷酸缓冲盐溶液、内参β-actin（武汉赛维尔生物科技有限公司）；胎牛血清（PAN，德国）；LPS、兔抗LC3B、P62 抗体（Sigma，美国）；兔抗Beclin-1 抗体（Abcam，英 国）；兔抗NLRP3、TLR4抗体（北京博奥森生物技术有限公司）；兔抗Caspase-1、ASC 抗体、内参GAPDH（武汉三鹰生物技术有限公司）；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG抗体（南京巴傲得生物科技有限公司）；3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）、雷帕霉素（rapamycin，RAPA）（MCE，美国）；CCK-8 试剂盒 （Dojindo， 日 本）； LipofectamineTM2000（Invitrogen Life Technologies，美国）；人源TLR4 过表达载体质粒、TLR4 siRNA（均由南京锐博生物科技有限公司设计）；RIPA裂解液（上海碧云天生物技术有限公司）。

1.2 A549细胞培养及实验分组

向人肺泡上皮细胞株A549 细胞中施加含10%胎牛血清的DMEM 高糖培养基，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。当细胞密度长至90%后弃培养液，磷酸缓冲盐溶液清洗2 次，以0.25%EDTA 胰酶消化细胞，调整细胞密度接种于细胞培养板中，培养至细胞稳定贴壁。

（1）浓度梯度分组：加入不同浓度（0、1、5、10 μg/mL）的LPS 工作液，刺激12 h；时间梯度分组：加入浓度为1 μg/mL 的LPS 工作液，刺激不同的时间（0、4、8、12、24 h）。收样前0.5 h加入三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）（浓度为5 mmol/L）。收集各组细胞沉淀，用于后续蛋白检测。

（2）细胞自噬抑制实验分为：对照组、LPS组、3-MA组、3-MA+LPS组。3-MA组和3-MA+LPS组加入浓度为5 mmol/L 的自噬抑制剂3-MA 与细胞共培养12 h。细胞自噬激动实验分为：对照组、LPS 组、RAPA 组、RAPA+LPS 组。RAPA 组 和RAPA+LPS 组加入浓度为100 nmol/L 的自噬激动剂RAPA 与细胞共培养12 h。LPS 的处理浓度为1 μg/mL，处理时间为12 h。收样前0.5 h加入ATP。收集各组细胞沉淀，用于后续蛋白检测。

（3）细胞转染实验分两部分，每部分各分4组：TLR4 过表达对照组、TLR4 过表达组、TLR4过表达对照+LPS 组、TLR4 过表达+LPS 组；TLR4沉默对照组、TLR4 沉默组、TLR4 沉默对照+LPS组、TLR4沉默+LPS组。

1.3 细胞转染

将细胞接种至6 孔板中，待细胞密度长至40%～60%时进行转染。转染前2 h 对细胞进行换液。通过构建质粒载体过表达TLR4，使用siRNA沉默TLR4，针对质粒和siRNA 进行转染工作液的配制：将4 μg 的TLR4 过表达/空载质粒DNA 和10 μL 浓 度 为20 μmol/L 的TLR4 siRNA 及 其 对 照siRNA 加至250 μL 的无血清培养基中，混匀，再将5～10 μL 的LipofectamineTM2000 加至另外250 μL的无血清培养基中，混匀，室温静置5 min，再将两者混合，室温静置20 min。从每孔中吸出500 μL培养基弃去，再按每孔500 μL 将上述配制的混合液加入，混匀，4～6 h 后换液，转染48 h。收样前0.5 h 加入ATP（浓度为5 mmol/L）。收集各组细胞沉淀，用于后续蛋白检测。

1.4 CCK-8法检测细胞存活率

将细胞接种于96孔板中培养12～24 h。以浓度为0、1、5、10 μg/mL 的LPS 刺激12 h；以浓度为1 μg/mL的LPS分别刺激0、4、8、12、24 h，收样前0.5 h 加入ATP，后每孔加入10 μL 的CCK-8 溶液，1～4 h 后应用酶标仪检测450 nm 处各孔吸光度。实验独立重复3次。

1.5 Western blot法检测蛋白表达

采用RIPA 裂解液提取细胞总蛋白，并经二喹啉甲酸法测定蛋白质浓度。通过SDS-PAGE电泳分离蛋白后转移到PVDF 膜上，5%脱脂牛奶室温封闭2 h，分别孵育相应抗体：微管相关蛋白1 轻链3B （microtubule associated protein 1 light chain 3 beta， MAP1LC3B， LC3B） 、 Beclin-1、 P62、NLRP3、Caspase-1、ASC、TLR4（均为1∶1 000配制），4℃过夜。TBST 洗膜（10 min×3 次），室温 孵 育 二 抗 （1∶5 000） 1 h， TBST 洗 膜（10 min×3 次），用ECL 发光剂荧光显色，在化学发光凝胶成像系统曝光观察蛋白条带。以GAPDH（1∶5 000）或β-actin（1∶1 000）作为内参，分析各条带灰度值。实验独立重复3次。

1.6 统计学分析

采用GraphPad Prism 8.0 进行分析和统计。正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用两样本t检验，多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用LSD-t法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LPS刺激对A549细胞存活率的影响

在培养的A549 细胞中以不同浓度（0、1、5、10 μg/mL） 的LPS 刺 激12 h， 与0 μg/mL 组（100.0%±0.0%） 相 比， 1 μg/mL 组（86.0%±1.2%），5 μg/mL组（72.8%±1.9%）和10 μg/mL组（63.6%±1.0%）的细胞存活率随LPS 浓度的增加逐渐降低；以1 μg/mL的LPS在A549细胞中刺激不同 的 时 间（0、4、8、12、24 h），与0 h 组（100.0%±0.0%） 相比，细胞存活率在4 h 组（97.67%±0.23%）、8 h 组（94.21%±0.65%） 及12 h 组（95.15%±0.59%）仅有轻微降低，24 h 组（72.33%±1.59%）则明显降低，差异均有统计学意义（P＜0.05），见图1。

图1 不同LPS 的刺激浓度和时间对A549 细胞存活率的影响

2.2 LPS对A549细胞炎症水平的影响

在培养的A549 细胞中以不同浓度（0、1、5、10 μg/mL） 的LPS 刺 激12 h，炎 症 指 标NLRP3、Caspase-1和ASC蛋白表达水平在1 μg/mL组升高并达到高峰，与0 μg/mL组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；以1 μg/mL 的LPS 在A549 细胞中刺激不同的时间（0、4、8、12、24 h），炎症指标NLRP3、Caspase-1 和ASC 蛋白表达水平均在12 h组升高并达到高峰，与0 h组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05），见图2及表1～2。

图2 LPS对A549细胞炎症蛋白表达的影响

2.3 LPS对A549细胞自噬水平的影响

在培养的A549 细胞中以不同浓度（0、1、5、10 μg/mL）的LPS 刺激12 h，自噬相关蛋白LC3B-Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1 和P62 的表达水平均在1 μg/mL 组升高并达到高峰，与0 μg/mL组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；以1 μg/mL 的LPS 在A549 细胞中刺激不同的时间（0、4、8、12、24 h），自噬相关蛋白LC3B-Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1 和P62 的表达水平均在12 h组升高并达到高峰，与0 h组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05），见图3及表1～2。

图3 LPS对A549细胞自噬相关蛋白表达的影响

表1 不同浓度LPS刺激各组炎症及自噬相关蛋白表达的比较 （±s，n=3）

表1 不同浓度LPS刺激各组炎症及自噬相关蛋白表达的比较 （±s，n=3）

注：a示与0 μg/mL组比较，P＜0.05。

组别NLRP3 Caspase-1 ASC LC3B-Ⅱ/ⅠBeclin-1 P62 0 μg/mL组1 μg/mL组5 μg/mL组10 μg/mL组F值P值0.557±0.006 96.67＜0.001 0.848±0.038a 24.16＜0.001 0.603±0.112 5.26 0.027 4.592±0.115 5.40 0.025 1.090±0.088 4.70 0.036 0.636±0.098 6.78 0.014 0.945±0.011 1.046±0.022a 0.774±0.035 0.546±0.026 1.033±0.051a 0.552±0.069 0.836±0.016 1.113±0.044a 0.917±0.138 4.371±0.509 6.395±0.036a 5.277±0.583 1.158±0.037 1.464±0.085a 1.293±0.083 0.880±0.031 1.258±0.044a 0.859±0.164

表2 LPS刺激不同时间各组炎症及自噬相关蛋白表达的比较 （±s，n=3）

表2 LPS刺激不同时间各组炎症及自噬相关蛋白表达的比较 （±s，n=3）

注：a示与0 h组比较，P＜0.05。

组别NLRP3 Caspase-1 ASC LC3B-Ⅱ/ⅠBeclin-1 P62 0 h组4 h组8 h组12 h组24 h组F值P值6.07 0.010 5.37 0.014 10.92 0.001 5.95 0.010 3.97 0.035 8.41 0.003 0.60±0.07 0.75±0.09 0.76±0.04 1.07±0.04a 0.72±0.10 0.475±0.005 0.661±0.105 0.643±0.092 1.002±0.123a 0.577±0.046 0.435±0.066 0.502±0.109 0.672±0.058 0.949±0.022a 0.815±0.028a 2.653±0.213 3.033±0.624 2.986±0.543 5.079±0.182a 4.146±0.306a 0.789±0.053 0.750±0.121 0.978±0.038a 1.045±0.036a 0.779±0.047??0.537±0.119 0.949±0.070a 1.110±0.077a 1.263±0.018a 0.928±0.136

2.4 LPS对A549细胞TLR4蛋白表达水平的影响

在培养的细胞中以不同浓度（0、1、5、10 μg/mL）的LPS 刺激12 h，TLR4 蛋白表达水平在1 μg/mL 组（0.585±0.054）升高并达到高峰，与0 μg/mL 组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；以1 μg/mL 的LPS 在A549 细胞中刺激不同的时间（0、4、8、12、24 h），TLR4 蛋白表达水平在12 h组（1.090±0.031）升高并达到高峰，与0 h 组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），见图4。

图4 LPS对A549细胞TLR4蛋白表达的影响

2.5 自噬对炎症的影响

2.5.1 自噬抑制剂3-MA对炎症及自噬相关蛋白表达水平的影响 在自噬抑制剂3-MA 的处理下，自噬相关蛋白LC3B-Ⅱ/Ⅰ蛋白表达水平明显降低，P62 蛋白表达水平明显升高；而炎症指标NLRP3、Caspase-1、ASC蛋白表达水平明显升高，与对照组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。经LPS（1 μg/mL，12 h）刺激后，3-MA+LPS 组自噬相关蛋白LC3B-Ⅱ/Ⅰ表达仍呈降低趋势，P62蛋白表达进一步升高；炎症指标NLRP3、Caspase-1、ASC蛋白表达水平则进一步升高，与LPS组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.05），见图5和表3。

表3 自噬抑制剂3-MA干预后炎症及自噬蛋白表达的比较 （±s，n=3）

表3 自噬抑制剂3-MA干预后炎症及自噬蛋白表达的比较 （±s，n=3）

注：a示与对照组比较，P＜0.05；b示与LPS组比较，P＜0.05。［LPS］脂多糖；［3-MA］3-甲基腺嘌呤。

组别对照组LPS组3-MA组3-MA+LPS组F值P值NLRP3 0.604±0.050 0.825±0.008a 0.956±0.108a 1.201±0.032b 16.29 0.001 Caspase-1 0.616±0.015 0.855±0.029a 0.687±0.006a 1.030±0.040b 50.51＜0.001 ASC 0.395±0.045 0.806±0.075a 0.839±0.109a 1.194±0.060b 18.35＜0.001 LC3B-Ⅱ/Ⅰ1.109±0.036 1.317±0.057a 0.645±0.073a 0.926±0.055b 25.28＜0.001 P62 0.790±0.120 1.210±0.046a 1.550±0.064a 1.497±0.088b 17.10＜0.001

2.5.2 自噬激动剂RAPA对炎症及自噬相关蛋白表达水平的影响 在自噬激动剂RAPA 的处理下，自噬相关蛋白LC3B-Ⅱ/Ⅰ表达水平明显升高，P62蛋白表达水平明显降低；而炎症指标NLRP3、Caspase-1、ASC蛋白表达水平明显降低，与对照组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。经LPS（1 μg/mL，12 h）刺激后，RAPA+LPS 组自噬相关蛋白LC3B-Ⅱ/Ⅰ表达进一步升高，P62蛋白表达则仍然是降低的；炎症指标NLRP3、Caspase-1、ASC蛋白表达水平仍呈降低趋势，与LPS组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.05），见图5和表4。

表4 自噬激动剂RAPA干预后炎症及自噬蛋白表达的比较 （±s，n=3）

表4 自噬激动剂RAPA干预后炎症及自噬蛋白表达的比较 （±s，n=3）

注：a示与对照组比较，P＜0.05；b示与LPS组比较，P＜0.05。［LPS］脂多糖；［RAPA］雷帕霉素。

组别对照组LPS组RAPA组RAPA+LPS组F值P值NLRP3 0.525±0.057 0.735±0.022a 0.143±0.017a 0.358±0.013b 59.26＜0.0001 Caspase-1 0.795±0.031 0.948±0.018a 0.570±0.075a 0.573±0.085b 9.61 0.005 ASC 0.722±0.027 0.944±0.027a 0.247±0.038a 0.349±0.065b 58.79＜0.0001 LC3B-Ⅱ/Ⅰ2.111±0.078 4.845±0.446a 11.700±0.507a 8.001±0.621b 80.56＜0.0001 P62 0.906±0.026 1.066±0.029a 0.432±0.109a 0.452±0.142b 12.29 0.0023

图5 自噬抑制剂/激动剂对炎症及自噬蛋白表达的影响

2.5.3 自噬抑制/激动剂对TLR4 蛋白表达水平的影响 在自噬抑制剂3-MA 的处理下，3-MA 组（0.531±0.036）较对照组（0.325±0.042）TLR4蛋白表达上调；经LPS（1 μg/mL，12 h）刺激后，3-MA+LPS 组（0.620±0.018）较LPS 组（0.475±0.032）TLR4蛋白表达水平进一步增加，差异有统计学意义（P＜0.05）；在自噬激动剂RAPA 的处理下，RAPA 组（0.392±0.088）较对照组（0.825±0.039） TLR4 蛋白表达下调；经LPS （1 μg/mL，12 h）刺激后，RAPA+LPS 组（0.445±0.129）较LPS 组（1.003±0.046）TLR4 蛋白表达水平降低，差异有统计学意义（P＜0.05），见图6。

图6 自噬抑制/激动剂对TLR4 蛋白表达的影响

2.6 TLR4对A549细胞炎症及自噬水平的影响

2.6.1 过表达TLR4 对A549 细胞炎症及自噬水平的影响 过表达TLR4 后，自噬相关蛋白LC3B-Ⅱ/Ⅰ表达明显降低，P62蛋白表达明显升高；炎症指标Caspase-1、ASC 的蛋白表达水平呈升高趋势，与TLR4过表达对照组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。 经LPS （1 μg/mL， 12 h） 刺 激 后，TLR4过表达+LPS组自噬相关蛋白LC3B-Ⅱ/Ⅰ表达仍是降低的，P62蛋白表达则进一步升高；炎症指标Caspase-1、ASC 蛋白表达水平进一步升高，与TLR4过表达对照+LPS组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.05），见图7和表5。

表5 TLR4过表达后炎症及自噬相关蛋白表达的比较 （±s，n=3）

表5 TLR4过表达后炎症及自噬相关蛋白表达的比较 （±s，n=3）

注：a示与TLR4过表达对照组比较，P＜0.05；b示与TLR4过表达对照+LPS组比较，P＜0.05。［LPS］脂多糖；［TLR4］Toll样受体4。

组别TLR4过表达对照组TLR4过表达组TLR4过表达对照+LPS组TLR4过表达+LPS组F值P值TLR4 0.552±0.014 0.634±0.020a 0.951±0.072a 1.236±0.056b 44.39＜0.001 ASC 0.662±0.017 0.920±0.089a 0.739±0.013a 0.980±0.063b 7.29 0.011 Caspase-1 0.425±0.030 0.512±0.009a 0.623±0.063a 0.869±0.048b 20.40＜0.001 LC3B-Ⅱ/Ⅰ6.075±0.321 4.962±0.196a 7.597±0.433a 5.153±0.519b 9.68 0.005 P62 0.198±0.004 0.233±0.008a 0.843±0.046a 1.011±0.033b 211.90＜0.001

图7 TLR4 过表达/沉默对A549 细胞中炎症及自噬蛋白表达的影响

2.6.2 沉默TLR4 对A549 细胞炎症反应及自噬水平的影响 沉默TLR4 后，自噬相关蛋白LC3B-Ⅱ/Ⅰ表达升高，P62 蛋白表达下降；而炎症指标Caspase-1、ASC 蛋白表达水平明显降低，与TLR4沉默对照组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）。经LPS（1 μg/mL，12 h）刺激后，TLR4 沉默+LPS组自噬相关蛋白LC3B-Ⅱ/Ⅰ的表达进一步升高，P62蛋白表达水平降低；炎症指标Caspase-1、ASC的蛋白表达水平进一步降低，与TLR4 沉默对照+LPS 组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.05），见图7和表6。

表6 TLR4沉默后炎症及自噬相关蛋白表达的比较 （±s，n=3）

表6 TLR4沉默后炎症及自噬相关蛋白表达的比较 （±s，n=3）

注：a示与TLR4沉默对照组比较，P＜0.05；b示与TLR4沉默对照+LPS组比较，P＜0.05。［LPS］脂多糖；［TLR4］Toll样受体4。

组别TLR4沉默对照组TLR4沉默组TLR4沉默对照+LPS组TLR4沉默+LPS组F值P值TLR4 0.831±0.038 0.563±0.087a 0.990±0.040a 0.756±0.062b 8.63 0.007 Caspase-1 1.024±0.026 0.900±0.023a 1.107±0.009a 0.982±0.042b 9.93 0.005 ASC 0.612±0.037 0.369±0.058a 0.794±0.037a 0.560±0.026b 18.07＜0.001 LC3B-Ⅱ/Ⅰ4.185±0.155 8.890±1.185a 11.660±0.723a 30.010±5.661b 15.05 0.001 P62 0.842±0.009 0.699±0.020a 0.997±0.040a 0.765±0.031b 21.75＜0.001

3 讨论

ALI/ARDS 的病理生理特点是破坏肺泡毛细血管膜屏障，导致过度炎症反应和肺功能障碍［6］。因此，抑制炎症对ALI/ARDS 至关重要。LPS 是革兰阴性菌细胞壁的主要成分，可刺激机体产生一系列炎症反应。特别是当LPS影响肺部时，会诱发ALI，严重时可发展为ARDS。因此，LPS被广泛用于ALI/ARDS临床相关动物或细胞模型的建立［7-8］。Ⅱ型肺泡上皮细胞的炎症损伤是ALI/ARDS发病过程中的主要病理生理变化，LPS暴露可导致这一变化［9］。而人肺泡上皮细胞株A549 与Ⅱ型肺泡上皮细胞特征最为相似，是体外构建ALI/ARDS炎症模型使用最为广泛的细胞系［10-11］。因此，本实验采用A549 细胞培养模拟LPS 诱导的炎症反应及肺损伤，是常用的替代原代细胞培养的方法。

在 本 研 究 中，A549 细 胞 经LPS （1 μg/mL，12 h）刺激后，炎症指标NLRP3、Caspase-1和ASC蛋白表达水平均升高并达到高峰。这些结果表明由LPS 诱导的A549 细胞炎症反应模型成功建立。同样条件下，自噬指标LC3B-Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1 和P62蛋白表达水平也升高达到高峰，这表明LPS虽然诱导自噬产生，但自噬流受到阻滞。自噬过程涉及几个步骤：启动和成核、扩增、自噬体形成、自噬体-溶酶体融合和降解。成核阶段磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）复合物的核心成分Beclin-1被激活以调节自噬体的大小和数量［12］。成核后，LC3-Ⅰ与磷脂酰乙醇胺结合，形成仅在成熟的自噬体上表达的LC3-Ⅱ形式。LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ转化的增加是自噬体形成的指标［13］。自噬体与溶酶体的融合是自噬货物降解的关键事件［14］。P62/SQSTM1作为一种机制来传递泛素化的蛋白质，通过与LC3相互作用靶向物质于自溶酶体处降解［15］。当自噬被抑制时P62 会积累，而当自噬被诱导时可以观察到P62 水平降低。因此，P62常用作研究动态自噬流的标志物。自噬流始于自噬体的形成，并以溶酶体的底物降解结束，LC3B 代表自噬流启动，而P62 代表自噬流终止，完整通畅的自噬流才能使自噬真正发挥作用，达到降解物质的目的。本研究CCK-8 实验结果显示，LPS浓度过高或者刺激时间过长都会对细胞造成较大的损害，影响各实验指标的表达。因此，结合上述实验结果，我们认为1 μg/mL 浓度的LPS 刺激12小时是诱导A549细胞炎症反应模型，探究自噬作用的最适条件。

为进一步探究自噬和炎症反应之间的关系，我们选择在细胞模型上调节自噬来观察炎症反应的变化。3-MA 是一种PI3K 抑制剂，通过阻止PI3KC3与beclin-1结合形成自噬体来抑制自噬，是常用的自噬抑制剂。RAPA通过抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）复合物的活性来激活自噬，是常用的自噬激动剂。在3-MA（5 mmol/L，12 h）的处理下，LC3B-Ⅱ/Ⅰ表达减少，P62表达增加，自噬受到抑制且自噬流受阻，而炎症指标NLRP3、Caspase-1和ASC蛋白表达水平升高；在此基础上，LPS的刺激使P62蛋白表达水平进一步升高，自噬流进一步受到阻滞，同时，NLRP3、Caspase-1 和ASC 蛋白表达水平也进一步升高。而当RAPA 激活自噬后，自噬流恢复通畅，炎症反应减轻。这些结果说明自噬流对炎症反应起到负调控的作用。这与许多研究结果一致，表明维持正常的自噬流具有潜在的抗炎作用，比如谷胱甘肽S-转移酶P1 通过抑制PI3K-Akt-mTOR通路促进自噬流通畅对LPS诱导的炎症反应发挥保护作用［16］；雌激素相关受体α 通过增加自噬流和控制宿主肠道微生物群来改善结肠炎症反应，从而充当肠道稳态的关键调节剂［17］；LPS可诱导自噬流阻塞而促发炎症反应，褪黑激素通过促进自噬流而具有有效的抗炎作用［18］。这也说明，维持一定水平的自噬是必要的，自噬在炎症反应中可起到一定的细胞保护作用。

TLR4被称为自噬的环境传感器［19］。在本研究中，LPS的刺激和3-MA的自噬阻断均可引起TLR4蛋白表达上调，而RAPA 的自噬激活则引起TLR4蛋白表达下调。为了确定TLR4对自噬及炎症反应的影响，我们使用TLR4 过表达/空载质粒和针对TLR4的siRNA/阴性对照siRNA转染A549细胞，用LPS 处理细胞并评估自噬流。研究结果显示，TLR4过表达组，LC3B-Ⅱ/Ⅰ表达减少，P62表达升高，自噬水平降低，自噬流阻滞；TLR4 沉默组，LC3B-Ⅱ/Ⅰ表达升高，P62表达减少，自噬水平升高，自噬流通畅，表明TLR4对自噬流具有负调控作用。在LPS 的刺激下，TLR4 过表达+LPS 组LC3B-Ⅱ/Ⅰ表达仍是降低的，P62表达则进一步升高，自噬流进一步受到阻滞；而沉默TLR4+LPS组自噬水平进一步升高，自噬流通畅，说明LPS 经TLR4 对自噬流具有负调控作用。同时我们发现，当自噬流阻滞时，炎症反应进一步升高；当自噬流通畅时，炎症反应减轻。自噬被认为是炎症反应的主要负调节因子［20］。本研究证明TLR4介导自噬流在LPS 诱导的A549 细胞炎症反应中发挥负调控作用。自噬对细胞的保护作用是建立在自噬流通畅的基础上，自噬流的通畅性抑制了LPS引起的炎症级联反应，这可能为ARDS有效的抗炎治疗提供一种新方法。

本实验仍有不足之处。在细胞系选择方面，没有使用原代肺泡上皮细胞，研究的借鉴意义相对受限，另外尚未进行在体动物实验验证，有待下一步深入研究。自噬流的检测方法除了免疫印迹法，还有自噬mRFP-GFP-LC3双标示踪法等，均有待后续补充。本研究中，我们对自噬的研究着眼于自噬流这一关键点，初步阐述自噬对ARDS中炎症反应的调控机制，这可能仅仅是自噬复杂调控网络中的一小部分，关于肺上皮细胞自噬的上游信号或调节因子我们依然知之甚少。自噬在肺损伤中扮演着“双刃剑”的角色，值得我们进行更多地探索。新生儿作为一个特殊的阶段，新生儿疾病的防治一直在不断更新与完善。通过自噬来了解和重新认识新生儿ARDS是一个新角度，可能为新生儿ARDS防治找到新的突破口，为降低新生儿疾病的发生率、病死率等作出贡献。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。