1 732例儿童血清维生素K2临床分析及其与骨代谢标志物关系的研究

杜长秀 李娜

（1.沈阳医学院，辽宁沈阳 110034；2.沈阳市儿童医院儿童保健科，辽宁沈阳 110032）

维生素K2（vitamin K2，VitK2）广泛存在于发酵食品或动物来源的食品中，主要由细菌合成，因多种侧链结构不同，被命名为四烯甲萘醌-n（menatetrenone，MK-n），其中较为重要的是MK-4和MK-7［1-2］。VitK2作为γ-谷氨酸羧化酶的辅酶［3］，参与骨相关维生素K（vitamin K，VitK）依赖性蛋白质羧化的生理过程，而骨钙素（osteocalcin，OC）作为骨相关VitK依赖蛋白质中最重要的一种，能直接反映成骨细胞和破骨细胞活性，是成骨细胞功能和骨质矿化的特殊标志物。目前国际推荐同时测量骨形成标志物和骨吸收标志物，可更好地协助临床医生判断人体内骨代谢的变化，预测骨丢失情况，评估治疗疗效。其中Ⅰ型前胶原氨基端前肽（type Ⅰ procollagen amino-terminal peptide，PINP）及Ⅰ型胶原交联羧基末端肽（typeⅠcollagen carboxy-terminal peptide，CTX）分别为国际上推荐的首选骨形成标志物及骨吸收标志物［4］。

van Summeren 等［5］随机对照试验研究中，给55例健康儿童补充MK-7，发现在不影响凝血功能的情况下，适量MK-7的补充可以增加OC的羧化，促进儿童骨骼健康发育。随着对骨健康研究的深入，发现儿童晚期和青春期是骨骼积累的关键时期，此期可以达到峰值骨量的95%［6］，如果在青春期末未达到其峰值，不仅影响儿童本身的生长发育，同时，成年以后患病理性骨折和骨质疏松的风险明显提升，所以儿童时期的骨骼健康至关重要［7］。国内外关于VitK 与骨代谢标志物的关系研究多基于成人（绝经期妇女、中老年），而国内关于儿童的临床研究较少，如胡雪松等［8］研究用VitK 治疗儿童失用性骨质疏松对骨生化指标及骨代谢标志物的影响，未明确区分VitK1和VitK2，故本研究通过测定VitK2和骨代谢标志物水平，了解儿童VitK2的营养分布状况，及其血清VitK2和骨代谢标志物（OC、PINP、CTX）相关性，以期为预防VitK2的缺乏和促进儿童的骨骼健康提供科学参考和建议。

1 资料与方法

1.1 研究对象

前瞻性选取2020 年10 月至2021 年10 月于沈阳市儿童医院儿童保健科门诊常规体检的儿童1 732例为研究对象，测定血清VitK2、25羟维生素D［25-hydroxyvitamin D，25(OH)D］水平。纳入标准：（1）0～14 岁常规体检儿童；（2）身高、体重达到标准的儿童；（3）家属同意并签署知情同意书。排除标准：（1）有明确先天性代谢病和内分泌疾病者（如低磷抗D佝偻病、甲状腺疾病、糖尿病、肝肾疾病）等；（2）患严重呼吸系统、消化系统、心血管系统、泌尿系统疾病患儿；（3）长期服用糖皮质激素或其他影响骨代谢药物（如噻嗪类利尿剂、肝素、抗惊厥药物、重组人甲状旁腺素）等。将受试者按年龄段分为＜1岁组、1～3岁组、＞3～6 岁组、＞6～14 岁组；根据血清VitK2水平分为VitK2正常组和VitK2缺乏组，分析各组间临床特征。

为排除维生素D对骨代谢的影响，将25(OH)D＜50 nmol/L儿童排除，同时剔除采血不足和资料不完整者，最终剩余309 例儿童，测定血清OC、PINP、CTX 水平，分析不同年龄段骨代谢标志物水平及其与血清VitK2的相关性。

本研究已获得沈阳市儿童医院医学伦理委员会的批准（2019001）。

1.2 相关定义

参考德国柏林医学诊断检验中心实验室标准，将血清VitK2＜0.1 ng/mL 定义为缺乏。体重指数（body masss index，BMI）=体重（kg）/身高（m²），参考中国0～18岁儿童、青少年BMI的生长曲线［9］，BMI≥85 百分位数（或+SD）为超重，BMI≥95 百分位数（或+2 SD）为肥胖。参考美国医学研究院报告［10］将血清25(OH)D＜50 nmol/L定义为缺乏。

1.3 血清VitK2和25(OH)D测定

1 732 例儿童于早晨空腹状态下采集静脉血2 mL，离心取血清1 mL，送至儿童神经康复实验室检测。采用高效液相色谱串联质谱法测定血清VitK2和25(OH)D，仪器型号为美国AB 4500MD，标准品均购自美国Sigma-Aldrich检验所，实验用水采用德国默克Milli-Q Diret8 60 LITER PE TANK 纯水化系统制备。

1.4 骨代谢标志物测定

309例儿童测骨代谢标志物，于清晨空腹抽静脉血4 mL，以3 000 r/min离心5 min，分离出血清，置于-20℃冰箱低温保存待测。采用双抗夹心酶联免疫吸附测定法测定OC、PINP 和CTX，通过绘制标准曲线计算样品所测指标浓度。酶标仪型号为日本BIORAD iMark，试剂盒均购自北京索莱宝公司。

1.5 统计学分析

采用SPSS 26.0 统计软件进行统计学分析。正态分布计量资料用均数±标准差（±s），多组间比较用单因素方差分析，组间两两比较用SNK-q检验；非正态分布计量资料用中位数（四分位数间距）［M（P25，P75）］表示，两组间比较用Mann-WhitneyU检验，多组间比较采用Kruskal-WallisH检验，组间两两比较用Nemenyi检验。计数资料用例数和百分率（%）表示，率的比较用χ²检验，多个样本率的两两比较用Bonferroni 法。相关性分析用Spearman 秩相关。以α=0.05 为检验水准，其中Bonferroni法以（α'=α/比较次数）为检验水准。

2 结果

2.1 1 732例儿童血清VitK2临床资料分析

1 732 例儿童中，中位年龄为7.3（3.8，10.7）岁，血清VitK2缺乏率为52.31%（906/1 732），睡眠不实、超重/肥胖、生长痛（≥3 岁）发生率分别为33.78% （585/1 732）、 15.65% （271/1 732），29.97%（519/1 732）。男童睡眠不实、超重/肥胖、生长痛（≥3 岁） 发生率高于女童（P＜0.05），见表1。

表1 男童和女童临床资料比较

VitK2缺乏组年龄大于VitK2正常组，食欲缺乏、超重/肥胖、生长痛（≥3岁）发生率高于VitK2正常组（P＜0.05）。2 组间无症状者比例、睡眠不实发生率差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 VitK2正常组和VitK2缺乏组临床资料比较

2.2 1 732例儿童血清VitK2水平分析

1 732 例儿童中位血清VitK2水平为0.1（0.1，0.2）ng/mL，不同年龄段间血清VitK2缺乏率、血清VitK2水平差异有统计学意义（P＜0.05）。经两两比较，＞6～14 岁组血清VitK2缺乏率高于1～3 岁组（P＜0.0083），血清VitK2水平低于1～3 岁组（P＜0.05）。见表3。

表3 不同年龄段血清VitK2的水平

2.3 309例儿童骨代谢标志物水平分析

＞3～6 岁组和＞6～14 岁组儿童血清CTX 水平低于＜1 岁组，＞3～6 岁组儿童血清CTX 水平低于1～3岁组（P＜0.05）；＞6～14 岁组儿童血清OC 水平高于＜1 岁组（P＜0.05）；＞3～6 岁组和＞6～14 岁组儿童血清PINP 水平高于＜1 岁组，＞6～14 岁组儿童血清PINP水平高于1～3岁组（P＜0.05）。见表4。

表4 不同年龄段骨代谢标志物的水平

2.4 VitK2与骨代谢标志物的相关性分析

经Spearman 秩相关分析表明，年龄与血清VitK2、OC、PINP 水平呈正相关（分别rs=0.136、0.433、0.415，P＜0.05）。年龄与血清CTX水平呈负相关（rs=-0.488），血清VitK2与OC 水平呈正相关（rs=0.347），血清CTX 与PINP 水平呈负相关（rs=-0.317），差异均有统计学意义（P＜0.01），而血清VitK2与 血 清CTX、PINP 无 相 关 性（P＞0.05）。见表5。

表5 各指标间的相关性

3 讨论

VitK2作为人类所必需的天然营养素，在体内广泛分布，其与γ-谷氨酰羧化酶具有高度亲和性，可利用氢醌的活化形式激活凝血因子、OC 和基质Gla蛋白发挥促进凝血、参与骨代谢、调节糖脂代谢、预防血管硬化等生理过程［11-12］。本研究中，超重/肥胖儿童血清VitK2缺乏率升高，这与国外研究［13］表明VitK2具有降脂作用一致。Sogabe 等［13］用MK-4 对雌性大鼠进行为期3 个月的喂养发现，与对照组相比，MK-4 的加用显著降低了总脂肪积累，且血清三酰甘油降低了29%。

由于血液中VitK2浓度低，其脂溶性易受脂质的干扰，因此测定血液中VitK2比较困难，国内外也没有儿童VitK2营养分布状况的确切数值，相关文献报道健康人群血VitK2水平高于绝经期女性和骨质疏松人群；日本人群高于欧洲人群，考虑与饮食和个体因素（如健康状态、年龄段、人种等）有关［14-17］。本研究中1 732例儿童血清VitK2水平的中位数为0.1（0.1，0.2）ng/mL，血清VitK2缺乏率为52.31%，不同年龄段儿童血清VitK2水平中位数均处于较低水平，这与我国饮食结构中普遍缺乏VitK2直 接 相 关［18］。1～3 岁 组和＞6～14 岁组 血清VitK2缺乏率、血清VitK2水平差异有统计学意义，考虑到＞6～14岁组是生长发育的高峰期，此期对营养素需求量较大有关；另一方面，人们对VitK2与骨骼健康相关认知较少，只注重维生素D、钙的补充，忽视VitK2营养状况有关，因此我们要重视VitK2日常监测与补充。但目前研究多基于VitK 的膳食补充，也未有VitK2的儿童推荐补充剂量。国外的MK-7 临床试验不良反应中，Ozdemir 等［19］对20 例3～18 岁地中海贫血的骨病患儿进行为期1 年的含有MK-7和骨化三醇膳食补充的过程中，未观察到不良反应，且依从性良好。根据美国药典委员会发表的对MK-7 安全性评价，认为MK-7 作为食品添加剂，儿童每日摄入量可高达1.5 μg/(kg·d)而对凝血功能没有不良影响［20］。上述结果皆表明VitK2作为食品补充是安全的，暂未有严重不良事件的发生，VitK2缺乏儿童可通过此方法补充。

维生素D 与VitK2共同参与调节骨代谢，维生素D 可在基因转录水平影响OC 的合成，且OC 合成与维生素D水平有关，多项研究报道维生素D与PINP、CTX 水平的相关性，但结论尚未统一。洪维等［21］在一项以1 389 例体检人群为对象的研究中，发现25(OH)D 与PINP 呈负相关，且仅在25(OH)D严重减低时，PINP水平出现有统计学意义的升高，但与CTX 无明显相关性，且CTX 水平在不同维生素D水平间的差异无统计学意义。但另一项以2 798例德国学龄儿童为对象的研究中，发现外周循环中维生素D浓度越高，反映骨吸收水平的CTX 浓度越低［22］。由此可得出骨代谢标志物与维生素D 含量相关，故将25(OH)D＜50 nmol/L 的儿童剔除，控制维生素D缺乏对试验研究的影响。

VitK2作为非肝组织中VitK 最丰富的形式，参与骨相关VitK 依赖性蛋白质的羧化。当机体中的成骨细胞进行成熟分化时，可表达出一种特异性的非胶原蛋白，即OC。OC 不仅可以调节骨吸收，而且在骨基质矿化和成骨细胞分化中起到关键作用。血清OC水平的升高提示骨形成速率加快，儿童时期骨代谢水平活跃，骨组织的形成大于吸收，从而实现骨量的积累，故儿童生长期血清OC水平多升高。本研究中，血清OC水平与血清VitK2、年龄呈正相关，＜1 岁组儿童血清OC 水平远低于＞6～14岁组，这与金轶［23］研究得出＞3个月至1岁儿童VitK缺乏严重，易发生骨代谢异常结论一致。＞6～14岁组血清OC呈较高水平，此现象考虑与青春期生长发育高峰骨代谢旺盛，骨形成速率加快有关。此外，还发现生长痛患儿VitK2缺乏率升高，血清VitK2又与血清OC 呈正相关，考虑VitK2缺乏可能是儿童骨痛产生的原因之一。国内外的多项研究也表明体内良好的VitK2状态有利于骨健康，对骨代谢异常疾病有一定的治疗作用。如康丽娟等［24］发现VitK可提高佝偻病患儿OC的羧化率，对佝偻病有一定的治疗作用；Nicolaidou等［25］发现对囊性纤维化儿童补充VitK 可改善患儿的整体骨健康状态。

CTX 作为Ⅰ型胶原降解产物，主要反映骨吸收的状态，检测血清CTX 水平可以预测骨转换的活跃程度，＜1岁组儿童血清CTX水平明显高于＞3～6 岁组和＞6～14 岁组，提示＜1 岁组骨转换水平活跃，符合婴儿期的生长发育规律。PINP 由成骨细胞分泌，反映骨形成状态，是新骨形成的特异性敏感指标，＜1岁组儿童血清PINP水平低于＞3～6岁组和＞6～14 岁组年龄组，血清PINP 水平与年龄呈正相关，提示随着年龄的增长实现骨量积累，促进其生长发育。骨代谢包括骨吸收和骨形成过程，破骨细胞吸收旧骨，成骨细胞生成新骨取代以完成骨转换，不同时期骨转换水平不同，本研究发现血清CTX 与PINP 水平呈负相关，提示CTX 与PINP 间存在相互转换、相互博弈现象，符合骨代谢的病理生理过程。在相关性分析中未发现血清VitK2与血清CTX、PINP 的关联性，考虑两指标只受维生素D的影响，也可能与本研究纳入样本量较小有关。

综上所述，VitK2与OC存在相关性，可通过作用于OC来调节骨代谢影响骨健康。血清VitK2缺乏组超重/肥胖发生率高于正常组，提示VitK2缺乏可能与超重/肥胖有关，建议临床医生及家长应高度重视超重/肥胖儿童VitK2的营养状况。本研究虽验证了VitK2与骨代谢标志物的相关性，但未对VitK2缺乏儿童进行相关研究，存在一定的不足。另外纳入本研究对象为我院门诊常规体检儿童，存在一定的选择偏倚，仍需大量前瞻性、多中心基于儿童的临床试验研究来获得VitK2的营养分布状况，并发布相应的临床预防及补充方案。

利益冲突声明：所有作者声明不存在利益冲突关系。