MicroRNA-196a靶向调节HDAC9对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响

李华峰 张广凤 张旭 鞠文文 王婧婷 吴桐

1.深圳大学附属华南医院内分泌与代谢病科，广东 深圳 518111 2.深圳市第三人民医院放射科，广东 深圳 518111 3.中山市人民医院内分泌与代谢病科，广东 中山 528402 4.齐齐哈尔医学院附属第三医院内分泌与代谢病科，黑龙江 齐齐哈尔 161000 5.齐齐哈尔医学院精神卫生学院，黑龙江 齐齐哈尔 161000

骨质疏松由机体骨量减少所致，是导致老年人骨折及骨折后不愈合的重要原因[1]，因此，探究成骨细胞介导的骨形成机制，有利于寻找促进骨形成的有效策略。成骨细胞在成骨分化过程中表现出各种特征，包括碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性增加，细胞外基质合成增加，矿化程度增加等[2]。这些过程涉及多种基因的激活或抑制，MicroRNA(miRNA)是单链小RNA，通过介导mRNA降解或翻译抑制实现对靶基因表达的抑制[3]，敲除miRNA生成所必需的Dicer酶，可显著抑制骨祖细胞向成骨细胞分化，影响胚胎存活[4]。近期报道[5]称miRNA-196a对成骨细胞的分化具有正向调节作用，然而具体机制待研究。本研究在Targetscan网站预测到组蛋白去乙酰化酶9(histone deacetylase 9，HDAC9)可能是miR-196a的靶基因，且已有研究显示HDAC9抑制剂可通过改善内源性间充质干细胞的成骨能力，促进小鼠骨量恢复[6]，推测miR-196a可能靶向下调HDAC9表达，促进成骨分化。基于此，本研究采用miR-196a mimics和miR-196a inhibitor处理MC3T3-E1细胞，初步探究miR-196a在MC3T3-E1细胞成骨分化中与HDAC9的调控关系及作用机制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1细胞：小鼠MC3T3-E1细胞，购自中国医学科学院细胞资源中心。

1.1.2试剂：α-MEM培养基、胎牛血清(FBS)(Gibco公司)；地塞米松、甘油磷酸钠、抗坏血酸(Sigma公司)；RNA试剂盒(Omega Bio-Tek公司)；反转录、TB Green®定量PCR试剂盒(TaKaRa公司)；miR-196a-mimics及miR-196a-mimics-NC、miR-196a-inhibitor及miR-196a-inhibitor-NC、pCMV-HDAC9及pCMV-HDAC9-NC(上海吉玛公司)；矿化结节(茜素红)染色试剂盒(碧云天)；ALP检测试剂盒(日本WAKO公司)；Histone H3、Histone H3(acetyl K9)、Histone H3(acetyl K14)、Anti-Histone H3(acetyl K23)、HDAC9、Runt相关转录因子2(runt-related transcription factor 2，Runx2)、ALP、骨桥蛋白(osteopontin，OPN)、胶原蛋白 I(collagen I，COL1)抗体，(Abcam公司)；引物(上海生工公司)，等。

1.1.3仪器：定量PCR仪(ABI公司)；CO2培养箱、自动酶标仪(Thermo公司)；倒置显微镜(Olympus公司)；电仪及转膜装置(BioRad公司)，等。

1.2 方法

1.2.1细胞培养和分组：MC3T3-E1细胞采用α-MEM培养基+10 % FBS培养，隔天换液，取对数期细胞进行实验。随机分组为：对照组(control，Cont)组(未转染，未诱导)、诱导组(未转染，进行成骨诱导)、miR-196a-mimics-NC组(转染miR-196a-mimics-NC后，进行成骨诱导)、miR-196a-mimics组(转染miR-196a-mimics后，进行成骨诱导)、miR-196a-inhibitor-NC组(转染miR-196a-inhibitor-NC后，进行成骨诱导)、miR-196a-inhibitor组(转染miR-196a-inhibitor后，进行成骨诱导)、miR-196a-mimics+pCMV-HDAC9-NC组(共转染miR-196a-mimics和pCMV-HDAC9-NC后，进行成骨诱导)，miR-196a-mimics+pCMV-HDAC9组(共转染miR-196a-mimics和pCMV-HDAC9后，进行成骨诱导)。采用α-MEM培养基+10 % FBS培养至MC3T3-E1细胞贴壁24 h后，换为无血清α-MEM培养基，使用Lipofectamine 3000试剂盒将RNA序列和或pCMV-质粒转染进各组细胞中，6 h后更换α-MEM培养基+10 % FBS培养12 h，再加入10-7mol/L地塞米松、10 mmol/L甘油磷酸钠和50 μg/L抗坏血酸[7]进行成骨诱导，培养72 h检测。

1.2.2定量荧光PCR(qRT-PCR)检测：使用RNA试剂盒提取MC3T3-E1细胞中总RNA。核酸检测仪分析A260/A280比率和RNA质量后，反转录合成cDNA。按照TB Green®PCR试剂盒说明书分别对miR-196a和HDAC9进行qRT-PCR扩增，读取各基因和内参的循环数(Ct值)，以GAPDH和U6为内参根据2-ΔΔCt公式计算HDAC9和miR-196a的表达量。miR-196a F：5’-UAGCAGCACAGAAAUAUU GGC-3’，miR-196a R：采用mRQ 3’引物；U6 F：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’、U6 R：5’-AACGCTT CACGAATTTGCG-3’；HDAC9 F：5’-TGCATCGG AAGCCTGCATAA-3’、HDAC9 R：5’-CGGTCTCT GTCTCCTCTTGC-3’；GAPDH F：5’-GGAGAGTGTTT CCTCGTCCC-3’、GAPDH R：5’-ACTGTGCCGTT GAATTTGCC-3’。

1.2.3ALP活性检测：收集1.2.1中MC3T3-E1细胞，加入150 μL曲拉通X裂解细胞，冻融两次后离心收集上清。取20 μL上清样品和100 μL底物缓冲液混匀，孵育15 min，加入100 μL终止液停止反应，震荡混匀后测量405 nm处光密度(OD)，根据标准曲线计算ALP活性。

1.2.4矿化程度检测：收集1.2.1中MC3T3-E1细胞，PBS清洗后加入2 mL 4 %甲醛固定20 min，换为1 mL茜素红溶液染色15 min，吸取200 μL上述混合液加入96孔板，测量540 nm处OD值，矿化程度以相对OD表示。弃去剩余混合液后在倒置显微镜下拍照。

1.2.5双荧光素酶报告实验：构建包含miR-196a结合位点的HDAC9 3’UTR序列(WT)或其突变(MUT)的重组质粒，即为pGL3-HDAC9 3’UTR-WT和pGL3-HDAC9 3’UTR-MUT。MC3T3-E1细胞分组为pGL3-HDAC9 3’UTR-WT+mimics-NC组、pGL3-HDAC9 3’UTR-MUT+mimics-NC组、pGL3-HDAC9 3’UTR-WT+miR-196a mimics组、pGL3-HDAC9 3’UTR-MUT+miR-196a mimics组，将pGL3-HDAC 3’UTR-WT或pGL3-HDAC 3’UTR-MUT与mimics-NC或miR-196a mimics共转染至以上4组MC3T3-E1细胞中，6 h后换为α-MEM培养基+10 % FBS培养，48 h后测定荧光素酶活性，相对荧光素酶活性用海肾荧光素酶活性标准化。

1.2.6Western blot检测：使用RIPA裂解液裂解1.2.1中各组MC3T3-E1细胞并提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。取30 μg蛋白进行电泳，电转印到PVDF膜，与5 %脱脂奶粉封闭液孵育后，加入1∶500或1∶1 000稀释的HDAC9、GAPDH、ALP、Runx2、COL1、OPN、Histone H3、Histone H3(acetyl K9)、Histone H3(acetyl K14)、Anti-Histone H3(acetyl K23)抗体4 ℃过夜，换为1∶2 000稀释的HRP标记二抗室温孵育1 h，ECL发光液避光显色后采集图像并分析条带灰度。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 miR-196a和HDAC9在MC3T3-E1细胞中表达情况

与Cont组相比，诱导组、miR-196a-mimics-NC组和miR-196a-inhibitor-NC组MC3T3-E1细胞中miR-196a表达增高(P<0.05)，HDAC9 mRNA和蛋白表达降低(P<0.05)；与miR-196a-mimics-NC组和诱导组相比，miR-196a-mimics组MC3T3-E1细胞miR-196a表达增高(P<0.05)，HDAC9 mRNA和蛋白表达降低(P<0.05)；与miR-196a-inhibitor-NC组和诱导组相比，miR-196a-inhibitor组miR-196a表达降低(P<0.05)，HDAC9 mRNA和蛋白表达增高(P<0.05)，见图1、表1。

图1 Western blot检测HDAC9在各组MC3T3-E1细胞中表达Fig.1 The expression of HDAC9 of MC3T3-E1 cells in each group detected with Western blotting

表1 miR-196a和HDAC9在MC3T3-E1细胞中表达情况

2.2 miR-196a对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响

与Cont组相比，诱导组、miR-196a-mimics-NC组和miR-196a-inhibitor-NC组MC3T3-E1细胞ALP、Runx2、COL1、OPN蛋白表达、ALP活性及矿化程度增加(P<0.05)；与miR-196a-mimics-NC组和诱导组相比，miR-196a-mimics组MC3T3-E1细胞ALP、Runx2、COL1、OPN蛋白表达、ALP活性及矿化程度增加(P<0.05)；与miR-196a-inhibitor-NC组和诱导组相比，miR-196a-inhibitor组MC3T3-E1细胞ALP、Runx2、COL1、OPN蛋白表达、矿化程度及ALP活性降低(P<0.05)，见图2，表2。

注：A：Western blot检测ALP、Runx2、COL1、OPN在各组MC3T3-E1细胞中表达。B：茜素红染色各组MC3T3-E1细胞(Scale bar=200 μm)。图2 miR-196a对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响Fig.2 Effects of miR-196a on osteogenic differentiation of MC3T3-E1 cells

2.3 miR-196a可靶向调节MC3T3-E1细胞中HDAC9的表达

Targetscan网站预测显示，HDAC9 3’UTR区存在miR-196a的结合位点，见图3。双荧光素酶报告实验发现，pGL3-HDAC9 3’UTR-WT+mimics-NC组、pGL3-HDAC9 3’UTR-MUT+mimics-NC组、pGL3-HDAC9 3’UTR-WT+miR-196a mimics组、pGL3-HDAC9 3’UTR-MUT+miR-196a mimics组相对荧光素酶活性为(0.99±0.05)、(1.01±0.08)、(0.39±0.04)、(1.03±0.09)，pGL3-HDAC9 3’UTR-WT+miR-196a mimics组显著低于其他三组(均P<0.05)。

图3 Targetscan预测HDAC9 3’UTR与miR-196a的结合位点Fig.3 The binding site of HDAC9 3’UTR and miR-196a predicted with Targetscan

2.4 miR-196a对MC3T3-E1细胞Histone H3乙酰化水平的影响

与Cont组相比，诱导组、miR-196a-mimics-NC组和miR-196a-inhibitor-NC组MC3T3-E1细胞Histone H3 K9、K14和K23位点乙酰化水平增加(P<0.05)；与miR-196a-mimics-NC组和诱导组相比，miR-196a-mimics组MC3T3-E1细胞Histone H3 K9、K14和K23位点乙酰化水平增加(P<0.05)；与miR-196a-inhibitor-NC组和诱导组相比，miR-196a-inhibitor组MC3T3-E1细胞Histone H3 K9、K14和K23位点乙酰化水平降低(P<0.05)，见图4，表3。

图4 Western blot检测各组MC3T3-E1细胞中Histone H3 K9、K14和K23位点乙酰化水平Fig.4 The acetylation levels of Histone H3 K9, K14, and K23 sites of MC3T3-E1 cells in each group detected with Western blotting

表3 各组MC3T3-E1细胞中Histone H3 K9、K14和K23位点乙酰化水平的比较

2.5 共转染miR-196a mimics和pCMV-HDAC9对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响

与miR-196a-mimics组和miR-196a-mimics+pCMV-HDAC9-NC组比较，miR-196a-mimics+pCMV-HDAC9组MC3T3-E1细胞ALP、Runx2、COL1、OPN蛋白表达、ALP活性及矿化程度降低(P<0.05)，见图5、表4。

注：A：Western blot检测ALP、Runx2、COL1、OPN在各组MC3T3-E1细胞中表达。B：茜素红染色各组MC3T3-E1细胞(Scale bar=200 μm)。图5 共转染miR-196a mimics和pCMV-HDAC9对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响Fig.5 Effects of co-transfection of miR-196a mimics and pCMV-HDAC9 on osteogenic differentiation of MC3T3-E1 cells

3 讨论

miRNA表达失调可能影响成骨细胞分化和骨形成，如miR-219a-5p在老年人骨组织中表达降低，过表达miR-219a-5p可增加ALP表达和活性，增强成骨活性[8]；miR-335-5p在小鼠胚胎的成骨细胞中高表达，过表达miR-335-5p可诱导小鼠的成骨分化和骨形成，促进颅面骨缺损的修复[9]；miR-664-3p在MC3T3-E1细胞成骨分化过程中表达下调，过表达miR-664-3p在体外可抑制成骨细胞活性和基质矿化，在体内则损害骨形成并引起骨量减少[10]。本研究发现，miR-196a在成骨诱导的MC3T3-E1细胞中表达增加，且高表达miR-196a后，MC3T3-E1细胞miR-196a表达、ALP、Runx2、COL1、OPN蛋白表达、ALP活性及矿化程度增加；低表达miR-196a则可显著降低MC3T3-E1细胞miR-196a表达、ALP、Runx2、COL1、OPN蛋白表达、ALP活性及矿化程度。成骨细胞是骨形成的主力细胞，首先合成并释放COL1累积大量细胞外基质，进一步成熟并发生矿化形成骨结节，最终实现骨量的增加[11]。Runx2为早期成骨细胞标志物，COL1为胞外基质中主要胶原成分，OPN、ALP为成熟成骨细胞标志物，其表达水平可反映成骨细胞的分化能力[12]。提示miR-196a在MC3T3-E1细胞中发挥促成骨分化作用。

miRNA主要通过与内源性mRNA竞争性结合，减少翻译蛋白质的mRNA数量或者抑制翻译，从而抑制蛋白表达[3]。如miR-143可通过靶向HDAC7抑制成骨细胞分化[13]；miR-27a可直接抑制PR结构域蛋白16基因(TGF-β信号通路的负调节因子)表达，进而调节TGF-β信号通路促进骨细胞分化[14]。本研究预测发现，miR-196a与HDAC9 3’UTR存在结合位点，且荧光素酶报告实验显示，miR-196a mimics可显著降低pGL3-HDAC9 3’UTR-WT的荧光素酶活性，进一步证实miR-196a与HDAC9 3’UTR存在特异性结合。本研究还发现，miR-196a-mimics可显著降低MC3T3-E1细胞中HDAC9表达并增加Histone H3 K9、K14和K23位点乙酰化水平，而miR-196a-inhibitor则明显增加MC3T3-E1细胞中HDAC9表达，同时降低Histone H3 K9、K14和K23位点乙酰化水平，提示miR-196a可靶向负调控HDAC9表达。HDAC9属于Ⅱ类HDAC，通过移去组蛋白和/或其他蛋白质中赖氨酸侧链上的乙酰基来控制基因转录[15]。最近证据显示，HDAC是骨形成和重建的关键调节剂，其中HDAC3促进骨形成[16]，而HDAC4[17]、HDAC8[18]和HDAC9[6]抑制骨形成。组蛋白乙酰化后构象发生改变，释放其聚合的DNA，有利于转录因子与DNA的结合，激活基因转录[19-20]，而HDAC可降低组蛋白的乙酰化水平，维持DNA-组蛋白复合物的稳定，阻止转录因子对基因转录的激活[21]。推测转染miR-196a-mimics后，HDAC9蛋白水平降低，其调控的去乙酰化作用减弱，使得Histone H3 K9、K14和K23位点乙酰化水平升高，有利于DNA从组蛋白复合物中释放并与Runx2等转录因子结合，启动ALP、COL1、OPN等基因表达，促进成骨分化。

综上所述，miR-196a可靶向下调HDAC9表达，增加组蛋白乙酰化水平，促进MC3T3-E1细胞成骨分化。本研究仅在细胞层面探究了miR-196a的促成骨分化作用，接着将进行动物实验，从组织学角度探究miR-196a对成骨分化的作用。