组蛋白甲基化酶SUV39H1过表达对C2C12细胞成骨分化的影响

王乾 黄晨 黄廷锐 孙攀 赵永见,3 施杞,3 王拥军,3 唐德志,3*

1.上海中医药大学附属龙华医院，上海 200032 2.上海中医药大学脊柱病研究所，上海 200032 3.教育部筋骨理论与治法重点实验室，上海 200032

随着我国交通事业的蓬勃发展，交通事故引起的创伤性骨折患者发病率逐年增高，由于交通事故通常暴力巨大，常导致骨不连和骨缺损等并发症[1-3]。这严重影响着患者的肢体功能和术后康复。如何提高患者的治愈率，改善患者的功能，成为每位骨科医师必须思考的问题。肌肉干细胞作为间充质干细胞的一员，由于来源广泛，易于取材且在一定条件下可向成骨细胞分化，因此逐渐成为骨组织工程研究极具潜力的种子细胞[4-5]。组蛋白甲基化作为组蛋白密码的重要组成部分，深刻影响着表观遗传学的调控[6-7]。而目前组蛋白甲基化酶SUV39H1对成肌细胞成骨分化影响的机制尚不明确。本实验将含有小鼠SUV39H1基因的慢病毒感染C2C12细胞，旨在探讨外源性SUV39H1基因对BMP2诱导的C2C12细胞成骨分化的影响，从而为进一步阐明SUV39H1调节成肌细胞成骨分化机制以及C2C12成肌细胞为代表的种子细胞早日在体内应用提供理论与实验依据。

1 材料和方法

1.1 实验细胞

实验细胞采用C2C12细胞，购自中国科学院细胞库。

1.2 主要试剂与仪器

DMEM高糖培养基购自Hyclone公司；Recombinant Human/Mouse/Rat BMP-2购自苏州近岸蛋白质公司；SUV39H1过表达慢病毒及GFP对照慢病毒购自吉满生物科技公司；总RNA提取，反转录及实时荧光定量PCR试剂盒购自EZBioscience公司；Western blot裂解液、BCA蛋白定量试剂盒及茜素红S试剂盒购自上海碧云天公司；BCIP/NBT碱性磷酸酶显色试剂盒，Runx2、ALP、H3、SUV39H1、GAPDH一抗购自CST公司；H3K9me3一抗购自Abcam抗体公司；相关二抗购自CST公司；PCR引物由上海华大基因合成。具体引物序列见表1。

表1 Real-Time PCR 引物序列Table 1 Primer sequences for real-time PCR

1.3 成骨诱导液配置

C2C12细胞采用DMEM高糖培养基培养，其内含有体积分数为5 %的胎牛血清，1 %的青霉素和链霉素。随后50 mL培养基内加入5 μg重组骨形态发生蛋白2，确保最终成骨诱导液最终浓度为100 ng/mL。

1.4 实验方法

1.4.1SUV39H1过表达稳转株的构建与筛选：实验首日取对数生长期的C2C12细胞均匀接种于24孔板内，采用常规培养方法培养。第二日取出-80 ℃冻存的慢病毒悬液，待病毒液冰浴融化后按照感染复数为50(MOI=50)加入SUV39H1过表达慢病毒及带有GFP的对照慢病毒。感染病毒24 h后，加入2.5 μg/mL的嘌呤霉素进行抗性筛选。连续进行6 d的抗性筛选，随后倒置荧光显微镜下观察感染效率。

1.4.2SUV39H1过表达稳转株的鉴定：将抗性筛选6 d后的SUV39H1过表达稳转株和GFP阴性对照组分别进行qRT-PCR实验和Western blot实验在基因和蛋白表达层面进行验证。

1.4.3成骨分化诱导：将胰酶消化好的对数生长期的C2C12过表达细胞和带有GFP的对照细胞，用新鲜培养基调整细胞密度为2.5×104个/mL，吸取2 mL细胞悬液接种于6孔板中，十字交叉摇匀法确保均匀接种，常规培养24 h。随后弃掉培养液加入含有BMP2(100 ng/mL)成骨诱导液继续培养。连续培养7 d后进行后续实验操作。

1.4.4形态学观察：倒置荧光显微镜下每日观察SUV39H1过表达稳转株的生长及诱导情况。

1.4.5碱性磷酸酶染色：C2C12细胞成骨诱导7 d后，弃掉6孔板中的培养基，用PBS冲洗两遍，随后每孔加入1 mL 4 %多聚甲醛固定液固定15 min，弃掉固定液，蒸馏水冲洗两遍后，按照碱性磷酸酶试剂说明书6孔板每孔加入1 mL染液，避光染色30 min。弃染液蒸馏水洗涤两遍后终止染色，随后进行拍照。

1.4.6茜素红染色：C2C12细胞成骨诱导12 d后，弃掉6孔板中的培养基，用PBS冲洗两遍，随后每孔加入1 mL 4 %多聚甲醛固定液固定15 min，弃掉固定液，蒸馏水冲洗两遍后,按照茜素红试剂说明书6孔板每孔加入1 mL染液，避光染色30 min。弃染液蒸馏水洗涤两遍后终止染色，随后进行拍照。

1.4.7qRT-PCR检测成骨相关基因的表达情况：C2C12细胞成骨诱导7 d后，弃掉培养基，用预冷的PBS洗涤两遍后，根据EZBioscience 总RNA提取试剂盒说明书提取RNA，测定RNA浓度并监测提取RNA的质量是否符合进行下一步反转录的要求。将符合要求的RNA按照1 μg/20 μL 的体系采用EZBioscience反转录试剂盒将其反转录成cDNA。以cDNA为模板，GAPDH为内参，按照EZBioscience实时荧光定量检测试剂盒说明书进行扩增。采用2-△△ct法计算SUV39H1过表达稳转株Runx2、ALP、OPN、OCN、MYOD的mRNA相对表达量水平。表1为扩增所需引物，PCR反应条件为：第1步，95 ℃ 5 min；第2步，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，共进行40个循环。

1.4.8免疫荧光检测RUNX2蛋白表达情况：将C2C12细胞过表达稳转株和GFP对照组按照2 000个细胞/孔的密度均匀接种于24孔板内，待细胞贴壁后加入成骨诱导液诱导培养。培养5 d后，用4 %的多聚甲醛进行固定20 min，弃固定液，PBS摇床洗3遍，每次5 min。随后加入0.3 %的Triton X100通透液透膜，PBS摇床洗3遍，每次5 min。封闭液室温封闭1 h，随后加入Runx2一抗4 ℃孵育过夜，孵抗兔二抗1 h，倒置荧光显微镜下拍照观察。

1.4.9蛋白免疫印迹法(Western blot)检测成骨相关蛋白表达：C2C12细胞成骨诱导7 d后，弃掉培养基，用预冷的PBS洗涤两遍后，根据总蛋白提取试剂盒说明书和核蛋白提取试剂盒说明书，6孔板中加入蛋白裂解液提取总蛋白和核蛋白。随后用BCA蛋白浓度检测试剂盒测定蛋白浓度，按照20 μg/20 μL的上样体系进行蛋白配置并热变性，随后加入分离胶浓度为12 %的SDS-PAGE中，80～100V电泳。湿转法转移至0.22 μm的PVDF膜上，采用快速封闭液室温封闭15 min，随后加入抗Runx2、ALP、H3K9me3、H3、GAPDH的一抗(Runx2、ALP、H3K9me3和GAPDH按照1∶1 000比例稀释；H3按照1∶2 000稀释)，4 ℃反应过夜，随后用TBST洗膜5 min1次，连续6次，加入偶联HRP的山羊抗兔二抗(按照1∶1 000比例稀释)室温孵育1 h，随后TBST继续洗膜6次每次5 min。随后用ECL显影液曝光拍照。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 细胞形态及转染效率观察

倒置相差显微镜下，SUV39H1转染的C2C12细胞和带有GFP的对照组细胞在形态上没有发现明显差异，细胞均表现为呈梭型。在绿色激发光下，SUV39H1过表达组和GFP对照组均呈现绿色。这说明C2C12细胞慢病毒转染效率较高，见图1。

图1 C2C12细胞SUV39H1转染后细胞形态及转染效率观察Fig.1 Observation of cell morphology and transfection efficiency of C2C12 cells after SUV39H1 transfection

2.2 C2C12细胞SUV39H1过表达稳转株鉴定情况

为了验证C2C12细胞稳转株的表达情况，我们首先进行qRT-PCR验证，发现SUV39H1过表达组较对照组可以明显提高SUV39H1的mRNA相对表达水平(P<0.05)。蛋白质免疫印迹结果同样显示SUV39H1过表达组与对照组比较可以明显提高SUV39H1的蛋白表达水平(P<0.05)。这说明SUV39H1过表达稳转株构建成功，见图2。

注：与SUV39H1-NC相比，**P<0.01，****P<0.0001。图2 SUV39H1过表达稳转株qRT-PCR和Western blot鉴定结果Fig.2 Identification of SUV39H1 over-expression strains by qRT-PCR and Western blotting

2.3 碱性磷酸酶染色

SUV39H1过表达组细胞和对照组细胞，在BMP2(100 ng/mL)成骨诱导液中诱导7 d，ALP染色显示，SUV39H1过表达组染色较对照组明显减弱，见图3。

图3 SUV39H1过表达对BMP2诱导的C2C12细胞碱性磷酸酶表达的影响Fig.3 Effect of SUV39H1 over-expression on BMP2-induced alkaline phosphatase expression in C2C12 cells

2.4 茜素红染色

SUV39H1过表达组细胞和对照组细胞，在BMP2(100 ng/mL)成骨诱导液中诱导12 d，茜素红染色染色显示SUV39H1过表达组钙化结节形成量较对照组少，见图4。

图4 SUV39H1过表达对BMP2诱导的C2C12细胞钙盐沉积的影响Fig.4 Effect of SUV39H1 over-expression on BMP2-induced calcium salt deposition in C2C12 cells

2.5 qRT-PCR检测成骨及成肌相关基因的表达情况

qRT-PCR结果显示SUV39H1过表达组Runx2、OCN基因的mRNA相对表达量均较对照组降低(P<0.05)，其中ALP、OPN、MYOD基因的mRNA相对表达量较对照组显著降低(P<0.01)，见表2。

表2 qRT-PCR法检测成骨及成肌相关基因mRNA表达结果

2.6 免疫荧光检测RUNX2蛋白表达情况

两组细胞成骨诱导7 d后进行免疫荧光检测。检测结果显示SUV39H1过表达组Runx2蛋白表达荧光强度低于对照组(P<0.05)，见图5。

注：与SUV39H1-NC相比，**P<0.01。图5 两组细胞Runx2免疫荧光及荧光强度分析Fig.5 Runx2 immunofluorescence and fluorescence intensity analysis of two groups of cells

2.7 蛋白免疫印迹法(Western blot)检测成骨相关蛋白表达情况

蛋白免疫印迹结果显示，SUV39H1过表达以后成骨分化相关蛋白Runx2和ALP相对于过表达对照组表达明显减弱，而H3K9me3表达增强。以上结果显示随着组蛋白H3的三甲基化水平增高会抑制相关成骨蛋白的表达，见图6。

注：与 BLANK相比，*P<0.05，**P<0.01；与SUV39H1-NC相比，#P<0.05。图6 蛋白免疫印迹法检测成骨相关蛋白表达情况Fig.6 Protein immunoblotting for osteogenesis-related protein expressions

3 讨论

既往对于骨缺损、骨不连的研究多关注自体骨移植和生物材料的应用[8-9]，但是受制于供骨供应不足，移植物易于感染，生物材料应用的高失败率等缺点，骨缺损和骨不连的临床治疗一直未能取得较大进展[10]。因此寻找合适的骨组织工程干细胞种子促进内源性修复是一种有前途的替代方案。肌干细胞作为间充质干细胞的一员，其成骨分化功能和治疗潜质的研究进展让我们看到了新的治疗方向[11]。最新的研究[12-13]显示肌源性干细胞不仅可以分化成软骨和骨，直接参与骨折愈合，并且在骨膜损伤严重的情况下可以发挥更大作用。这可能是由于骨折产生的信号通过起旁分泌因子作用进而促进肌源性干细胞向成骨细胞分化[14]。肌肉不仅可以促进骨折端血管重建、提供骨生长因子来源、甚至本身可作为干细胞的来源潜在地影响骨折愈合[15]。相反通过A型肉毒毒素引起股四头肌短期萎缩则可以导致大鼠股骨骨折愈合不良情况的出现[16]。鉴于肌肉在骨折愈合中发挥着重要作用，我们可以形容肌肉是骨折愈合中的第二层骨膜。因此，促进肌源性干细胞的成骨分化是治疗骨折愈合不良的潜在方向。

SUV39H1作为组蛋白赖氨酸甲基转移酶，能够三甲基化修饰组蛋白H3第9位的赖氨酸残基(H3K9me3)，使目的基因的启动子处于紧密折叠的状态，从而不利于目的基因与转录因子、RNA聚合酶接触，引起被修饰基因的转录沉默，常与异染色质形成有关[6,17]。组蛋白甲基化酶SUV39H1在成肌分化及癌症领域的作用研究已经相当深入。组蛋白H3甲基转移酶SUV39H1可以通过降低C2C12细胞MEF2C的表达抑制肌源性终末分化[18]。SUV39H1 在 MLL-AF9 诱导的 AML 进展中起肿瘤抑制作用[19]。SUV39H1 的抑制剂F5446 可以抑制人类结肠癌细胞的生长[20]。但是其在成骨诱导中的作用特别是肌干细胞成骨诱导中的作用还有待探索。

本研究中我们首先在C2C12细胞中构建SUV39H1过表达的稳转株，使其能够持续过表达SUV39H1。因此可以避免质粒瞬转引起的假阳性结果。随后用BMP2对C2C12过表达稳转株进行成骨诱导。其形态有梭型逐渐转变为圆形，并呈鹅卵石样生长。说明成骨诱导成功。在随后的Western blot、qRT-PCR、免疫荧光、ALP和茜素红染色中我们发现SUV39H1高表达会降低Runx2、ALP等相关成骨蛋白的表达。这提示SUV39H1对BMP2诱导的C2C12细胞的成骨分化有一定的抑制作用。

综上所述，本研究表明SUV39H1过表达可以抑制BMP2诱导的C2C12细胞相关成骨蛋白的表达，这为肌干细胞成骨分化表观遗传学的研究提供了相关实验数据和理论支持。但是组蛋白甲基化酶SUV39H1具体通过调控哪些反式作用因子引起成骨表观遗传学改变的分子机制，以及如何应用SUV39H1促进肌干细胞向成骨分化的临床应用是我们亟待回答的问题也是我们后面研究的重点。