动物体细胞诱导干细胞技术概述及拓展训练

2022-10-17广东朱叮叮

教学考试(高考生物) 2022年6期

广东朱叮叮

一、技术概述

细胞全能性是指细胞经分裂和分化后，仍具有产生完整有机体或分化成其他各种细胞的潜能和特性。高度分化的植物细胞可以通过植物组织培养技术培养成完整植株，但动物体细胞全能性很难实现，目前尚无成功将单个已分化的动物体细胞培养成新个体的成功案例[1]。类似于植物组织培养中的脱分化，将动物体细胞培育成完整个体或其他器官组织，首先要将动物体细胞诱导为干细胞。

当前，异体器官和组织移植存在严重的问题：一是缺乏供体，没有足够的移植器官来源；二是存在免疫排斥反应，异体移植的器官会逐渐产生功能衰退。自体体细胞转化为干细胞，再用干细胞进行诱导培养分化为特定组织器官，可以完美解决上述问题，所以动物体细胞诱导为干细胞是生命科学的研究热点，目前学界有3种主流方法：核移植法、转录因子转化法和化学诱导法。

1.核移植法

核移植是一项非常成熟的技术，在高中生物学教材选择性必修3中有详细的介绍，研究者将动物体细胞细胞核移植到一个去核的卵母细胞中，再用物理或化学方法激活重组细胞，进而植入母体子宫培养得到个体。1956年约翰·格登爵士将非洲爪蟾蝌蚪的上皮细胞的细胞核移植到去核的卵细胞中，并培育得到蝌蚪，第一次成功克隆动物；1996年英国科学家培育克隆羊多莉，第一次成功克隆哺乳动物；2017年11月27日，中国科学家培育克隆猴“中中”和“华华”，第一次成功克隆灵长类动物。该技术可以采用动物的多种体细胞，并且已经在多种哺乳动物中成功(牛、羊、鼠和猴等)实现。

核移植技术目前应用具有局限性的原因包括：(1)需要借助卵母细胞，哺乳动物的卵母细胞数量缺乏；(2)灵长类动物重组细胞的存活率极低(2007年Byrne等的研究中构建的304个卵母细胞中只有2个重组细胞株系成功存活)；(3)重组细胞遗传物质与体细胞并不完全一致，其线粒体基因不同；(4)使用生殖细胞，面临伦理困境，无法开展临床实验。

2.转录因子转化法

转录因子(transcription factor)是一类结合DNA调控区域[例如增强子(enhancer)和沉默子(silencer)]的蛋白质，转录因子通常结合到目的基因的上游(5′端)，并可以调节该基因的转录。人类基因组中已经发现了很多基因控制着转录因子的合成，转录因子有很多家族，每个家族都有一些共同结构特征，例如螺旋-转角-螺旋(helix-turn-helix)、螺旋-环-螺旋(helix-loop-helix)和锌指(zinc Finger)等。干细胞中有一些特殊的转录因子，对于维持细胞的全能性有重要作用，研究者将这些特殊的转录因子基因借助载体转化到动物体细胞中，并使其成功表达，从而诱导动物体细胞转化为干细胞。

起初研究者并不清楚哪些转录因子在这个过程中起作用，他们利用化学物质改变细胞膜通透性，接着将干细胞的细胞提取物导入到动物体细胞中，然后再从中筛选出成功转化的细胞。这种方法成功率低，而且转化成功的细胞遗传背景复杂，不利于后续研究的展开，所以逐渐被淘汰。2006年，日本科学家山中伸弥选取了24个转录因子基因，然后将其分别与病毒载体结合，一起导入到小鼠成纤维细胞中，结果成功诱导出了多能干细胞(induced pluripotent stem cell，iPS细胞)。山中伸弥和他的学生高桥和利接着采用减法原则进行实验，每次去掉一种重组病毒载体，保留其他23种重组病毒载体进行实验，成功筛选出了能够将小鼠成纤维细胞诱导为iPS细胞的4个关键转录因子：Oct3/4,Sox2,c-Myc和Klf4[2]。后续研究发现这些转录因子基因也可以用来将人类体细胞转化为iPS细胞，山中伸弥和克隆动物第一人约翰·格登爵士因此一起分享了2012年的诺贝尔生理或医学奖。iPS细胞在临床再生医学中应用前景广阔，它们分裂能力强，并可分化为体内所有其他类型的细胞，可以应用于因损伤或疾病而受损的器官或组织的移植。目前已经有一些成功应用的案例，例如2014年日本科学家利用老年性黄斑变性患者本人体细胞体外诱导培养为iPS细胞，接着继续分化培养为角膜细胞，并成功进行移植，有效改善了患者视力，后续又成功进行了多例类似手术。

3.化学诱导法

转录因子转化法操作相对复杂，而且可能在体细胞中掺入病毒或其他载体上的DNA序列，存在安全风险。为克服上述问题，一些研究者在山中伸弥开创性工作基础上进行创新，他们发现采用某些化学物质会对细胞的转录因子表达产生影响，从而诱导动物体细胞转化为干细胞。转录因子的表达受表观遗传影响，如DNA的甲基化水平，组蛋白的甲基化水平和组蛋白的乙酰化水平等；此外转录因子表达还会受到细胞中一些激酶的影响，如Rho激酶、糖原合成酶激酶3(GSK3)和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)等。

人类细胞的表观遗传调控是非常复杂和严格的，将人类体细胞诱导为干细胞长期以来一直无法突破，2014年甚至出现了日本科学家小保方晴子学术造假事件。近些年来，随着技术不断进步，该领域成果也逐渐增多，中国科学家2022年在此领域有两个突破性的贡献：2022年3月21日，中国科学院和深圳华大生命科学研究院等多家机构在Nature发文，实现了人类体细胞到全能干细胞(8细胞阶段)的突破，该研究采用了“鸡尾酒”(多种化学物质)诱导法，并借助华大自主研制的单细胞建库测序平台(DNBelab C4)实现了对全能干细胞的快速筛选[3]。2022年4月13日北大-清华生命联合中心邓宏魁研究团队在Nature发文，该团队进行了大量化学小分子的筛选和组合，最终发现高度分化的人类体细胞在特定的化学小分子组合的作用下，可以发生类似植物脱分化的现象，最终培养得到iPS细胞[4]。

人类体细胞诱导干细胞研究在再生医学上应用广泛，但也面临着一些伦理风险。例如人的判定问题，培养中的人类胚胎干细胞是否可以视作人；如果不是，又该将胚胎发育的哪个阶段开始定义为人。利用胚胎干细胞生成各种器官组织，是否有谋杀生命或者将人商品化的嫌疑。目前学界的研究都需要事先安排伦理委员会进行审查，临床应用也需要提前申请并接受审查。技术在不断进步，时代也会不断发展，相信未来会有更加清晰具体的伦理规则，干细胞再生医学方面的研究也会极大地造福全人类。