云南重楼ITS序列单核苷酸多态性与甾体皂苷特征的相关性分析

尹鸿翔，张开元，任梓萱，赵家雯，蒋桂华, 陈蓉*

云南重楼ITS序列单核苷酸多态性与甾体皂苷特征的相关性分析

尹鸿翔1，张开元2，任梓萱1，赵家雯1，蒋桂华1, 陈蓉1*

(1.成都中医药大学民族医药学院，成都 611137；2. 四川新绿色药业科技发展有限公司，四川 彭州 611930)

为了解云南重楼(var.) ITS序列的单核苷酸多态性(SNP)特征与其甾体皂苷构成特征的相关性，并探讨其对药材质量稳定性的影响，利用MegAlign软件对37份云南重楼样本的ITS序列进行对比，根据SNP位点进行分型；采用HPLC法测定7种甾体皂苷成分(重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、H和薯蓣皂苷)；用SPSS 25.0软件和SIMCA-P 15.0软件对各基因型甾体皂苷构成特征进行统计分析。结果表明，云南重楼ITS序列存在40个双等位多态性位点，其中碱基转换32个，碱基颠换8个，根据SNP特征可划分为2类基因型YN-I和YN-II。6种甾体皂苷(重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ、H、薯蓣皂苷)在云南重楼广泛分布，而重楼皂苷Ⅴ稀少。YN-I和YN-II的药典指标成分总含量分别为1.070%和0.93%，样本合格率分别为68.42%和77.78%；YN-I的甾体皂苷总含量为1.65%，YN-II为1.32%。方差分析表明，2类基因型的甾体皂苷特征存在一定程度的区别，但药典指标成分无显著差异，药材应该具有等效性。聚类分析和主成分分析表明，YN-Ⅰ的离散度更高，YN-Ⅱ的聚集度更好，表明YN-II的药材质量更加稳定，植株个体的甾体皂苷合成和累积差异更小，YN-II的SNP特征对云南重楼良种选育的分子遗传标记筛选具有重要意义。

云南重楼；ITS；单核苷酸多态性；基因型；甾体皂苷

云南重楼(var.)是重楼属的多年生草本植物，又名滇重楼，与七叶一枝花(var)共同作为中药重楼的法定基原，收载于《中国药典》[1]。云南重楼主产于我国西南地区，随着重楼栽培产业的发展，因其优良的药材质量，成为主要的栽培种源[2]。中药材DNA条形码研究表明云南重楼种内遗传变异丰富, ITS序列存在明显的单核苷酸多态性(single nucleo- tide polymorphism, SNP)[3–4]，并由此划分为2种基因型(YN-I和YN-II)。为了避免2种基因型并存导致真伪鉴定结果出现“假阴性”，开发了同时鉴别2种基因型的多重PCR鉴别体系[4]。

然而，目前尚无报道云南重楼ITS序列的SNP现象是否会引起植株在化学成分构成上的分化，进而在种内衍生出不同的化学型？研究这一问题对于丰富云南重楼种质资源多样性具有重要意义，并可能发现具有筛选价值的分子遗传标记。同时，根据2018年国家药品监督管理局发布的《中药材生产质量管理规范》(征求意见稿)的要求，中药材的优良品种选育，禁用人工选育的多倍体或者单倍体品种、种间杂交品种和转基因品种。因此，从云南重楼野生种群的自然变异类群中优选良种，将是未来重楼育种的主要途径，探索ITS区的SNP现象与药材质量的关联性将为实现这一目标提供重要参考。

本研究对云南重楼YN-I和YN-II型植株进行田间观察，发现形态学特征并无明显的分化[4]。为进一步了解是否会引起植株化学型的分化，进而影响药材质量，本研究收集了云南重楼不同产区的样品，根据其ITS序列的SNP特征进行基因型的鉴别，然后对不同基因型的7种甾体皂苷类成分(重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、H、薯蓣皂苷)进行测定，分析基因型与甾体皂苷构成的相关性，探讨其对药材质量的影响，为云南重楼的质量控制和良种选育提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 材料

云南重楼样本共37份，分别于2019—2021年采自云南、贵州、四川3省的主产区，根据采集年月编号凭证标本，样本详细信息见(表1)。样品经成都中医药大学尹鸿翔副教授进行原植物鉴定，根据李恒系统，均符合云南重楼的特征(图1)；再经ITS序列同源性比对鉴定为云南重楼(var.)，凭证标本藏于成都中医药大学标本馆(CDCM)。

1.2 仪器和试剂

Legend Micro 21R离心机(美国Thermo); BSA 124S分析天平(Sartorius科学仪器有限公司); MK-10干式恒温器(杭州奥盛仪器有限公司)；PCR仪(杭州博日科技有限公司)；DDY-12电泳系统(北京六一仪器厂)；激光成像仪Typhoon 7000 (通用电气医疗集团生命科技部)；微量紫外-分光光度仪(Thermo Nanodrop 2000)。Agilent technologies 1200series 高效液相色谱仪(DAD检测器)，色谱柱COSMOSIL Cholester RP-C18 (4.6 mm×250 mm, 5m)，BP121S电子分析天平(万分之一)，ULUP-I-10T优普超纯水机(成都超纯有限公司)，SB-5200D超声波清洗器(宁波新艺超声设备有限公司)，SHZ-DⅢ型循环水式多用真空泵(上海一科仪器有限公司)，BCD-202D型冰箱(北京海信电器)，DTF-100A型手提式高速万能粉碎机(温岭市林大机械有限公司)，DZKW-4型电子恒温水浴锅(北京中兴伟业仪器有限公司), 101-3- BS型电热恒温鼓风干燥箱(上海跃进医疗器械有限公司)。

表1 云南重楼样品

续表(Continued)

图1 云南重楼。A: YN-I型；B: YN-II型。

琼脂糖(广州赛国生物科技有限公司)，Goldview I型核酸染色剂(北京索莱宝科技有限公司)，EasyDNA聚合酶，10×EasyBuffer (Mg2+plus) (北京全式金生物技术有限公司), DNA Marker-B, dNTPs Mixture Solution (生工生物工程股份有限公司)，植物组织DNA提取试剂盒(成都福际生物技术有限公司)，-高聚淀粉酶(思科生物科技有限公司)。色谱纯乙腈(TEDIA)，超纯水，分析纯乙醇为(Fisher), 重楼皂苷I (批号：111590-201604，纯度93.6%)、Ⅱ (批号: 111591-201103, 纯度93.4%)、Ⅵ (批号：111592- 201604, 纯度98.0%)、Ⅶ (批号: 111593-201604, 纯度94.0%)均购自于中国食品药品检定研究院；薯蓣皂苷(批号：19057-60-4)购于上海甄准生物科技有限公司。重楼皂苷H (纯度98.3%)、Ⅴ (纯度97.1%)由本课题组制备[5]。

1.3 单核苷酸多态性分析

参照张开元等[4]的方法，采用ITS序列通用性引物ITS-4/ITS-L对37份样本进行扩增，扩增产物送成都擎科梓熙生物科技有限公司测序，利用Megalign软件对测序结果进行校对与分析，找出具有稳定差异的SNP位点，然后进行基因分型。

1.4 甾体皂苷构成特征分析

采用李朋等[5]的方法，对37份样品的7种甾体皂苷含量进行测定，平行测定3次，取平均值，完成定性、定量对比分析。根据《中国药典》一部重楼项下含量测定标准[1]进行合格率评价。

1.5 聚类分析和主成分分析

采用SPSS 25.0基于平均联结(组间)谱系图法对样本的甾体皂苷构成特征进行聚类分析(CA)，采用SIMCA-P 15.0软件进行主成分分析(PCA)。

2 结果和分析

2.1 SNP和基因型划分

采用Megalign软件对37份样本的ITS序列进行校对，扩增的ITS序列包含ITS1、5.8s rDNA和ITS2等3个片段。SNP有40个位点，其中ITS1区有SNP位点18个，5.8s rDNA区1个，ITS2区21个。40个位点均为双等位多态性，其中发生碱基转换的有32个，碱基颠换的有8个(表2)。依据SNP位点多样性可以划分为2种基因型，分别编号为YN-I和YN-II，其中YN-I型有19份(1～19号)，YN-II型18份(20～37号)。

表2 云南重楼ITS区的SNP位点特征

灰色底纹为碱基颠换，其余为碱基转换。

Gray shading indicate base transversion and the rest indicates base transition.

2.2 甾体皂苷构成特征分析

以7种甾体皂苷对照品的进样量(g)为横坐标，色谱峰峰面积(A)为纵坐标，绘制对照品的标准曲线，拟合回归方程。7种甾体皂苷色谱峰面积的RSD为0.316 5%～1.261 4%，表明方法的精密度良好; 重复性试验的RSD为0.613 6%～2.115 5%，表明重复性良好；且对照品和供试品溶液中7种甾体皂苷在24 h内基本稳定；7种甾体皂苷的平均加样回收率为99.71%～99.60%，均符合测定要求。

37份样品的测定结果见表3，7种甾体皂苷对照品、YN-I型和YN-Ⅱ型的HPLC特征见图2。根据2020年版《中国药典》一部重楼项下规定，重楼皂苷I、II、VII之和不少于0.6%评价合格率。从表3可见，重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ、H和薯蓣皂苷等6种甾体皂苷在云南重楼中广泛分布，但重楼皂苷V较稀少，37份样品中仅有8份出现。除样品1、2、3、4、5、6、24、28、31和34外，其余27个样品均达到《中国药典》的含量标准，整体合格率达72.97%，其中YN-Ⅰ型的合格率为68.42%,YN-Ⅱ型为77.78%。YN-I型的药典指标成分总含量平均为1.070%，YN-II型为0.93%; YN-I型的7种甾体皂苷总含量平均为1.65%，YN-II型为1.32%。以基因型为影响因素，进行单因素方差分析(One- Way ANOVA)，结果表明YN-I型和YN-II型的药典指标成分含量无显著差异(>0.05)，但7种甾体皂苷总含量有显著差异(<0.05)，说明2类基因型的甾体皂苷构成存在一定的分化。

2.3 聚类分析

采用SPSS 25.0软件对37批样品的甾体皂苷构成特征进行聚类分析，构建树状聚类图(图3)。当相似性距离为5～10时，37个样品聚为4支，其中Ⅰ-14、Ⅰ-15聚为第1支(A)；Ⅰ-8、Ⅰ-18、Ⅰ-19聚为第2支(B)；Ⅱ-8独立成第3支(C)；其余31个样品聚为第4支(D)。第4支成员众多，当相似性距离<5时明显分为2个亚支，Ⅰ-16、Ⅱ-3、Ⅱ-4、Ⅱ-11、Ⅱ-16和Ⅱ-18聚为一亚支(D-1)，其中YN-Ⅰ型1个和YN-Ⅱ型5个；其余25个样品聚为另一亚支(D-2)，包括YN-Ⅰ型13个和YN-Ⅱ型12个。可见，不同基因型的样品可以聚类到同一分支中(如D-1和D-2)。

图2 云南重楼和对照品HPLC图。A: 7种甾体皂苷对照品; B: YN-I型; C: YN-II型; 1: 重楼皂苷VII; 2: 重楼皂苷H; 3: 重楼皂苷VI; 4: 重楼皂苷II; 5: 薯蓣皂苷; 6: 重楼皂苷I; 7: 重楼皂苷V。

表3 样品的甾体皂苷成分含量

续表(Continued)

产地对甾体皂苷构成特征具有一定程度的影响，A支的Ⅰ-14、Ⅰ-15均来自贵州六枝；Ⅱ-8是唯一的单独产地样品(四川德昌)，独立成C支；Ⅰ-4、Ⅰ-5、Ⅰ-6和Ⅱ-5虽然分属2个基因型，但均来自贵州长顺而聚在一起。

2.4 主成分分析

采用SIMCA-P 15.0软件对37份样品的甾体皂苷含量进行主成份分析(PCA)，标定了3个主成份, 分别绘制了基于2个主成分的二维得分图(图4: A)和基于3个主成分的三维投影图(图4: B)。从图4可见，37个样品的甾体皂苷成分构成特征虽无明显的基因型分化，但仍然表现出一定程度的影响，图3中聚在一起的Ⅰ-4、Ⅰ-5、Ⅰ-6和Ⅱ-5等4份样品在图4: A中出现了分化，前三者仍然聚为一簇，但和II-5明显分离。另外，YN-Ⅰ样品的离散度较高，而YN-Ⅱ样品的聚集度更好，其中Ⅰ-8号和Ⅰ-18号样品在Hotelling’s T2 (95%)下甚至表现为强异常值；这一特征也进一步在图4: B的三维投影图中得到体现。

同时，地理位置对甾体皂苷构成特征同样表现出一定影响，在图4: A中，Ⅰ-1、Ⅰ-2和Ⅰ-3号样品(均来自贵州兴义)明显聚集，Ⅰ-4、Ⅰ-5和Ⅰ-6号样品(均来自贵州长顺)明显聚集，和图3的聚类分析结果一致；Ⅱ-12、Ⅱ-13和Ⅱ-14 (均来自云南宣威)明显聚集，在图4: B中，单一产地样品Ⅱ-8 (四川德昌)明显偏离其他样品，也和图3的聚类结果一致。

图3 基于甾体皂苷特征的聚类图

3 结论和讨论

重楼栽培种的种内甾体皂苷特征被相继报道[5–6], 对云南重楼的种内变异研究涉及了分子遗传标记、形态学特征及其与甾体皂苷类成分的关联性[7–11],然而遗传多样性与甾体皂苷特征的相关性却未见报道。本研究首次报道了云南重楼ITS序列的SNP特征和甾体皂苷类成分的相关性。结果表明，重楼皂苷Ⅴ的分布稀少，与吴钰颖等[12]的报道相似，这应该是重楼皂苷V没有纳入《中国药典》含量指标的原因之一。2个基因型在《中国药典》合格率上有一定差异，YN-Ⅱ型>YN-Ⅰ型，但是7种甾体皂苷总含量上YN-Ⅰ型却显著大于YN-Ⅱ型。二者在这两项指标的不同反差提示，YN-Ⅱ型在甾体皂苷合成与累积方面个体差异小，更加稳定一致。PCA分析表明，YN-Ⅱ样品的聚集度更好，YN-Ⅰ样品的离散度更高，也印证了上述推测。究其原因，虽然绝大多数SNP存在于非编码区(ITS1和ITS2)，但5.8S rDNA区的SNP却可能会影响核糖体的转运功能，进而影响甾体皂苷累积的稳定性。这是否对已知的甾体皂苷合成途径及关键酶基因的表达产生影响，如甲羟戊酸途径(MVA)[13–14]、鲨烯合酶(SQS)[15]、鲨烯环氧酶(SE)[16]、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶(MVD)[17]、环阿屯醇合酶(CAS)[18]、细胞色素P450单加氧酶[19]等,还需要进一步验证。另外，参考华重楼基因组结构[20]对2类基因型的叶绿体基因组进行分析，探讨光合作用效率是否影响皂苷合成也是一个探索方向，在云南重楼良种选育的遗传标记筛选中具有独特价值。

图4 主成分分析。A: 二维得分图; B: 三维投影图。

相对于基因型，地理位置对甾体皂苷构成特征具有更明显的影响，出现了3类现象：(1) 产地相同的样品聚在一起，甚至单独产地样品独立成一支(如Ⅱ-8)；(2) 不同产地样品聚在一起；(3) 相同产地样品不聚在一起。究其原因，甾体皂苷作为次生代谢产物，其合成与累积也受到环境因子的调控, 相同的地理位置往往具有相似的生态环境，导致相似的化学特征，因此聚在一起，特殊生境的植株甚至独立成支。同理，不同产地的植株若小生境相似，也可能聚在一起；反之，产地相同但是小生境差异较大，植株化学特征则必然分化[21]。这提示，地理位置及其小生境对于甾体皂苷构成具有明显的影响，为保证重楼药材质量稳定，一定要选择生态适宜区并保持种植地的小生境一致。

综上，云南重楼YN-Ⅰ型和YN-Ⅱ型的甾体皂苷构成特征存在一定程度分化，但药典指标成分仍无显著性差异，二者在生产、监管和临床使用上不必区分对待。YN-Ⅱ型植株甾体皂苷累积的个体差异小，其SNP标记对于云南重楼的良种选育具有明显意义。虽然YN-I型的合格率较低，但是平均总皂苷含量更高，在重楼总皂苷的生产中可作为优良的提取原料。

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Correlation Analysis Between Single Nucleotide Polymorphism of ITS Sequences and Profile of Steroidal Saponins Composition ofvar.

YIN Hongxiang1, ZHANG Kaiyuan2, REN Zixuan1, ZHAO Jiawen1, JIANG Guihua1, CHEN Rong1*

(1. College of Ethnomedicine, Chengdu University of Tradition Chinese Medicine,Chengdu 611137, China; 2.Sichuan Neo-Green Pharmaceutical Technology Development Co. Ltd.,Pengzhou 611930, Sichuan,China)

In order to understand the correlation between characters of single nucleotide polymorphism (SNP) of internal transcribed spacer (ITS) sequences and composition of steroidal saponins ofvar.the effect of SNP on the quality stability of medicinal materials, the ITS sequences of 37 samples were compared by MegAlign, and then classified according to SNP loci. In addition, 7 steroidal saponins (polyphyllin Ⅰ, Ⅱ, Ⅴ, Ⅵ, Ⅶ, H, dioscin) in samples were determined by HPLC-DAD. The steroidal saponin composition characteristics of each genotype were statistical analysis by SPSS 25.0 & SIMCA-P 15.0.The results showed that there were 40 double-allelic polymorphic sites in ITS sequences ofvar., including 32 base conversion sites and 8 base inversion sites. According to SNP characteristics, 37 samples were divided into two genotypes: YN-I and YN-II. Six kinds of steroidal saponins (polyphyllin Ⅰ, Ⅱ, Ⅵ, Ⅶ, H, dioscin) were widely distributed in samples, while polyphyllin Ⅴ was relatively rare. The mean total content of pharmacopoeia index components inYN-I and YN-II were 1.070% and 0.93%, which the sample pass rate were 68.42% and 77.78%, respectively. The mean total content of 7 steroidal saponins were 1.65% and 1.32%, respectively. ANOVA analysis showed that there was significant differentiation of steroidal saponins profile between two genotypes, while there was no significant difference in the index components of pharmacopoeia, so the medicinal value of two genotypes should be equivalent. Cluster analysis (CA) and principal component analysis (PCA) showed the dispersion of YN-I was higher than that of YN-II, indicating the quality of medicinal materials of YN-II was more stable and the individual differences in steroidal saponins synthesis and accumulation in YN-II was smaller than YN-I. Therefore, the SNP characteristics of YN-II were of great significance for the screen of molecular genetic markers in the breeding ofvar..

var.; ITS; Single-nucleotide polymorphism; Genotypes; Steroidal saponin

10.11926/jtsb.4494

2021-08-05

2021-11-05

国家自然科学基金项目(81573545)；成都市科技局技术创新研发项目(2019-YF05-00346-SN)；成都中医药大学杏林学者学科人才计划项目(QNXZ2018039)资助

This work was supported by National Sciences Foundation of China (Grant No. 81573545); the Project for Technology Innovation and Research and Development of Chengdu Science and Technology Bureau (Grant No. 2019-YF05-00346-SN); and the Program for Apricot Grove Scholars of Chengdu University of TCM (Grant No. QNXZ2018039).

尹鸿翔，男，博士，副教授，研究方向为中药及民族药资源可持续利用及质量评价。E-mail: hongxiangy@126.com

. E-mail: 498064364@qq.com